April 2221
Vol.41 No.4
Basle & Clinical Medicine
2021年 4月 第41卷第4期
文章编号：1221-6325(2221)24-0467-05
基础医学与临床
研究论文
张 "1孙 阳1王蓉蓉1张 文"，张 学"
(1.中国医学科学院基础医学研究所北京协和医学院基础学院麦库西克-张孝骞协和遗传医学中心
医学分子生物学国家重点实验室，北京100025 ； 2.中国医学科学院北京协和医学院北京协和医院风湿免疫科
国家皮肤与免疫临床医学中心卫生部重点实验室，北京102732)
扌商要：目的对一例X-连锁无丙种球蛋白血症(XLA)患者进行致病基因变异鉴定。方法收集患者及家庭成员临
床资料并采集外周血，从患者外周血中提取基因组DNA 并进行全外显子组测序，筛查可疑致病变异，并对其父母 基因组DNA 进行Sanger 测序验证及基因型-表型共分离分析，从患者外周血中提取RNA，反转录为cDNA 后进行
Sanger 测序，同时进行实时定量PCR 实验检测该基因表达水平，进而对该变异的致病性和致病机制进行分析。结
果患者携带B7X 基因a.242+3A>C 新变异，该变异遗传自母亲，在家系中呈基因型-表型共分离，该变异体在
dbSNP153、ExAC 、g nomAD 和HGMD 等公共数据库未见报道。该变异属于剪接变异，c DNA 测序显示该变异造成 B7X 基因3号内含子5，端126 bp 碱基插入到第3号和第4号外显子之间，引起阅读框改变，最终导致终止密码子
提前出现。患者B7X 基因mRNA 表达水平明显降低。结论B7X 基因a. 242+3A>C 处剪接变异可能导
致该患者患
X-连锁无丙种球蛋白血症。
关键词：X-连锁无丙种球蛋白血症；全外显子组测序技术;B7X 基因；致病变异
中图分类号:R556.2
文献标志码:A
Idertification of a novel BTK variant
in a Chinese family with X-linked aaammaaloOulinemia
ZHANG Han 1，SUN Yang 1，WANG Rong-rong 1，ZHANG Wen 2*
*，ZHANG Xue 1*收稿日期亡。?。-?-? 修回日期：2221表112
基金项目：国家重点研发计划项目(2216YFC0925102)；国家自然科学基金(81788121)；中国医学科学院医学与健康科技创
新工程项目(2216D2MDD02&2217D2MDD01)
*
通信作者(corresuonding authoa ) : x pezhang@ pumc.edu.ch ；zhanywey91@ sina
(1. McKusicC-Zhang Centro foo Genetic Medicige, Stats Key LaSorahro of Medical Molecular Biolo-y ，
Institute of Basia Medical Sciences CAMS ，School of Basia Medicine PCMC ，Beijing 150075 ； 2. Deyartment of Rhenmatoloyy ,免充气内胎
Nationai Clinicai Researcli Center Ooa Dermatolooia ang Immunologic Diseases (NCRC-DID)，Key LaSoraha of Minista of Health ， Peding Unicm Medicat Colleae Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences, Peding Unicrn Medicat Colleae,Beijing 157730，China)
Abstract : Objective To inentify thn pdthoneyic yeridet in a Chinese famiiy with X-linked agammaglonulinemin (XLA). Methodt A
famiiy witli
spspsu C
X-linged agammaglonulinemio was recruited. Thn pathoneylc
yeCdet was detected Sy tha whotn exomn sequencing ，ang they confirmed Sy Sangac sequencing. cDNA sequencing was peUouned 1u at tha ancounat s plicing of tha BTK
Quantitative real-timn PCR was cangucted 1u evelu-
ata tha mRNA expression of BTK in t ha patiedt. Resulh A cov I hemizyyons splicing yeUdgi (c . 244+3A>C) was
468基础医学与临床Basic&Clinical Medicine2021.41(4)
iCedtified in thd BTK gedd from this patiedt.Thd variant ca-sedredated with thd phenotype of thd famiiy members was oot listed in the publta datarasds,such ae dbSNP153, ExAC,goomAD oo the Humao Gedd Mutatioo Datarasd. Furthdo Sanodo sequedcino demonstrated that the BTK a.244+3A>C yaridot led to a156bp from introo3of BTK insertioo betweed exon3and exon4of the BTK transcaph TFa mRNA expression of BTK in the卩血^!:was sinnifis cantip reduced as compared to a cootroO inoividuai.C onclusions Tie ooal a.244+3A>C splicino variad in BTK lineip resclis in X-linked agammaglonulinemid in this famiip.
Key words:X-linOed aaammaolonulicemia；whole exome sequencino；BTK；pathooenic variant
先天性无丙种球蛋白血症（conoeqital agamma-globulinemia）是一种罕见的原发性免疫病，其血清免疫球蛋白水平低下和外周血B细胞。该病X-连锁遗传，体遗传和体遗传的。其中B7K变异导致的X-连锁无丙种球蛋白血症（X-linked agammaglobulinemia,XLA；OMIM302753）占先天性无丙种球蛋白血症的85%。1954年Brutoo 最早报道XLA，故又被称为Brutoo|[52]。美国XLA患者登记的结果，该病的发病率约为1/35.2万例活产（1/15万例男婴。中国目前尚无XLA患病率或发病率的准确估计。XLA是由于位于Xq22.4上的Tea家族成员Brutoo酪氨酸激酶（Brutoo tyrosine kinase,BTK）基因发生变异导致的一种原发性体液免疫病，是典型的原发性B细病。BTK基因变异会使得B细胞系发育障碍，血清免疫球蛋白合成不足，最终导致患者感染易感性增加[5'58]0
本研究结合临床表型、全外显子组测序技术（whoie exome sequencing,WES）、Sanger测序和实时定量PCR，通过相关基因诊断技术和遗传学分析，对一例XLA患者进行研究，为该病的基因诊断、遗传咨询以及提供依据。
1材料与方法
1.1材料
1-4.4研究对象：男性,31岁，由于3个月内反复发热到北京协和医院风湿免疫科就诊。在获得患者及其家的知情同意后，收集患者及其家的临床资料、家族史并对患者进行临床诊断及家系分析（图5。该研究遵循赫尔辛基宣言（H dienoenD daia oa hno o3获得中国医学科学院基础医学研究所伦理委员会的审查批准（审批文号:215-2215)。
The square represents male,the circle represents
female,the black symboi represents iHoess,the
proOand is indicated bp ao arrow
图1X•连锁无丙种球蛋白血症家系图谱
Fig1Pedioree diagrdm of the family with
X-linked gammaglobiiUnemio
1.4.2试剂:DNA提取试剂盒（QIAGEN公司）；引物合成（北京天一辉远生物科技有限公司）TezO试剂盒（（nvitroged公司）；反转录试剂盒（TaKaRa公司）。
1.2研究方法
1.2.4样本的采集与DNA的提取：留取患者及父母的血样本并用全血DNA试剂盒提样本基因DNA。
1.2.2WES测序筛选变异：取患者外周血基因组DNA1^g送至北京诺禾致源科技限公司进行WES和分，使用HnSdu4522PE145
序系统（美国Ilumina公司）进行子组测。进行分和筛选:1）遗传
关X-连锁遗传和体遗传的变异，不排除新生变异;2）选位基因频率W 2.221的变异;3）关注位于基因编码区且改变所编码蛋白质的变异及可能改变mRNA剪接的变异，如非同义变异、移码变异和位点变异;4）针对候选基因的基因及对变异的进行预测，得到候选基因变异体2215
年美国
单相计数器张盼一例x-连锁无丙种球蛋白血症患者BTK基因新变异体的鉴定469
医学遗传学和基因组学学会(ACMG)针对序列变异的标准和，对所得到变异的进行分类，关注分致病、可疑致病和意义不明确的变异。
1-2.3Sanger测序验证：针对WES筛选出来的变异位点设计引物，从UCSC基因库(http：// geromr.ucsc.edu/)获取基因序列信息，利用Primer3 Ingut(version4.3.0)(http：////)进行在计引物，由北京天一辉远生物科技有限公司合o PCR扩增患者及父母DNA样本后，扩增产物送北京诺赛基因公司进行测序o
1.2.0RNA的提取及cDNA测序：用Trizol试剂盒提取患者及其父血中总RNA，使用试剂盒反转录2陆RNA获得cDNAo PCR扩增患者及其父亲cDNA样本后，扩增产物送北京诺赛基因司进行o
1.0.5实时定量PCR检测mRNA：以p-Actio为内参，使用荧光定量PCR仪(QuantStudio®3ReelTime PCR Instrume/i)检测BTK mRNA的相对表达量。数据采用2-AA C)法分析，具体：40=目标基因C)均值-内参基因C)均值,AA Ci=患者△Ct-健康对照厶心。实时定量PCR实验重复3o
烫贴2结果
2.1临床信息
患者(图1)男性,31岁，因反复发热、咳嗽就诊。自诉自发热，复的上感染及肺部感染，咳嗽、咳痰，否认痰中带血。既往患
o患者因无因
、水样诊断为“慢性结”，血。
电磁炒货机发关o患者生o患者父母
史，患者其男病。母亲妊娠期间无异常o
2.2实验室检查
患者血清免疫球蛋白IgA、IgM、IgG显著降低，ngE致o患者血分
，外周血B：(CD19+)百分比为0，显著降低。自然杀伤细胞(CD16+CD56+)百分比轻微降低，外周血T细胞(CD3J CD4、CD8J CD4/ CD8+)正常。2.2WES测序结果分析和Sanger测序验证
通过WES测序，总共得到10G的，平均深度>100
*o通过上述分析流程，鉴定出患者在B7K(NM_000061)的3号内含子c.244+3A>C处有一变异,Sangeu测序发现该变异来源于其母亲，符合家系基因型-表型共分离(图2)o该变异在USNP153数据库、ExAC数据库、gnomAD数据库以及人类基因突变数据库(Human Geee Mutation Dn-
图2患者及其父母BTK变异位点测序图Fig2Sangrr sequence chromatograms of thr
BTK varianh in the pahenh and hie parents 2.4cDNA测序和mRNA定量检测
cDNA测序显示c.244+3A>C变异BTK3号内含子5，端109bu碱基插入到BTK转录本第3号和第4子，弓变，纟子提前出现(图3)o实时定量PCR显示，与无血缘关系男性(control)及其父亲(I A)相比，患者(HA)BTK的mRNA表达水平明显降低(图4)。
3讨论
无丙种球蛋白血症一种由B
早期发育障碍所致的原发性免疫病，包括X-连锁遗传、体遗传和体遗传。其中,XLA是一种由于B期发育障碍所致的原发性免疫缺陷病，呈X-连锁遗传。患者多于6到12个月病，其最突出的临床特征为早发、反复的严重感染⑼。XLA
感染部位
47。基础医学与临床Bnic&Clinich-Medicige2021.41(4)
A.sanger sequeyce chromatonrams of the BTK cDNA；
B.schernatyc preseytatiou irayram of BTK cDNA
图3患者及其父亲BTK cDNA测序图及模式图
Fig3Sanger sequence cCramatogramt and scCemahc presentation diagram of the BTK cDNA
in the patient and his father
The values preseyted are meam of triplicate Uetermina-
tions,the controi was set te 1.4,the Y-axis represeyteU
the relative expression of BTK，the results of the exper
iment were repeatei three tinies
沼气发酵罐
图4患者及患者父亲BTK相对表达量
Fig4Relative mRNA erpression of the BTK
in the patient and hit father(元±,=3)
包括呼吸系统和消化系统，另外，还容易出现中耳
炎、慢性鼻窦炎、皮肌发症[6]0因该患者有反复的感染史，实验室检查结果显示血清免疫球蛋白减少，外周血成熟B淋巴细胞缺如，怀疑其患有先天性无丙种球蛋白血症，因此需对患者进行基因检测辅助临床诊断。
BTK变异分XLA的诊断依据°BTK基因位于Xq22.1，长度为37kb，包含有19个外显子。该基因编码的细胞质酪氨酸激酶蛋白(BTK)含有5个功能结构域，分别为PH、TH、SH2、SH3和TK[12D)]，已报道的变异主要包括错义变异、无义变异、插入或缺失变异和剪接变异等，暂未发现突变热点区域。其分子会导致B发育障碍和障碍，致免疫球蛋白和特异性抗体产生障碍^^o本研究中患者a24+ 3A>C变异，HGMD中未见报道，该突变导致来自3号内含子5'端的16Sp碱基插入到BTK转录本3子和4子，
子,mRNA发生降解，最终导致患者XLA疾病的发生0
BTK变异体检测有助于XLA早期诊断。全外显子技术的快速发展和广泛应用，有助于BTK变异的鉴定。XLA如果不正规将会导致该病发病率和病死率激增⑶。早期诊断并给予有效有助于减少患者反复的感染，避免严重并发症的发生，改善患者的生存质量。自1652年Bruton成功地使用替代免疫球蛋白疗法了第一例患者以来，免疫球蛋白替代疗法一直是XLA的，目静脉注射免疫球蛋白(intravecous immunogloSuyn，IVIG)途径和皮下注射免疫球蛋白(suScutageous immunoulonulin，scv)途径两种^^^o
综上所述，本研究结合患者临床表型、实验室检查结果以及患者遗传学结果，鉴定了一个XLA 的致病基因变异，为该患者的基因诊断、遗传咨询以及提供了依据；发现了BTK c.244+3A>C这一新的变异位点，丰富了BTK基因变异数据库
。
张皓一例X-连锁无丙种球蛋白血症患者BTK基因新变异体的鉴定471参考文献:
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