一、目的：统一项目操作规程，严格检验质量标准，为临床提供及时、可靠的结果报告。 二、适用范围：结核杆菌涂片检查
三、操作人员：检验科授权工作人员
四、操作步骤：
1、 原理
抗酸染的基本原理是抗酸菌具有耐受酸性介质脱的生物性状。此类细菌在石碳酸（苯酚）的协同作用下，被复红染剂着，能够耐受酸性乙醇脱，显微镜观察时保持紫红；而其它脱落细胞或标本中的非抗酸菌被酸性乙醇脱后，可被复染剂亚甲蓝染为蓝。 2、 染液的配制
2.1碳酸复红染液：全省统一配送
2.2 5%盐酸乙醇脱液： 35%浓盐酸5mL与95%乙醇混合
2.3亚亚甲蓝染液：全省统一配送
文具盒生产过程用于多媒体网络中控AFB检查的载玻片要求：
⑴ 一张载玻只能涂抹一份痰标本。
⑵ 每张载玻片只能使用一次，不得清洗后再次用于AFB涂片检查。新的载玻片放入95%乙醇中浸泡2小时脱脂，用摄子夹出放干净纱布上阴干，放无尘容器（培养皿）中备用。
4、 本的采集、运送及处理
4.1初诊病人应送3份痰标本（夜间痰、晨痰和即时痰）。如无夜间痰，在留晨痰后2-3小时再留取一份痰标本；或在送痰时，留取两份即时痰。疗程中或复诊随访病人按期每次送检2份痰（晨痰和夜间痰）。痰标本性质：干酪痰、血痰、粘液痰为合格标本；唾液或口水为不合格标本，除照常进行涂片检查外，应要求患者重新送检。
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4.2收集标本的容器应采用WHO推荐的标准痰瓶，或采用直径4厘米、高2厘米的可密封塑料盒或蜡纸盒（我省统一采用蜡纸盒）。★痰容器上就注明与检验单一致的病人姓名、编号（初诊病人门诊序号或随访病人登记号）、★检查项目和容器序号1、2、3（1为当日即时痰，2为夜间痰。3为晨痰）。
5、涂片的制备
5.1 编号：
取经干燥、清洁、无油污、无划痕的新载玻片制备涂片，在玻片背面左端1/3处注明实验室序号(56001递增)及标本序号（按1递增）（如使用的载玻片一端无磨砂面，须用玻璃刻刀注明编号；如使用的载玻片一端有磨砂面，可用2B铅笔在磨砂面上直接书写）。
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5.2制备涂片
小心打开装盛痰标本的容器，防止产生气溶胶或使标本外溢。仔细观察标本，使用折断的竹签茬端，挑取痰标本中干酪样、脓样或可疑部分约0.05-0.1ml，于玻片正面右侧2/3处均匀涂抹成10mm×20mm的卵圆形痰膜（新版一角硬币大小）。痰膜朝上静置，自然干燥后
（一般约30min）进行染镜检。
★涂抹完毕后的痰标本，在报告结果前应暂时保留。
★为保证检验人员的安全，严禁在涂抹痰标本的同时对载玻片进行加热。
5.3染：
萋—尼氏染步骤
⑴ 涂片自然干燥后，放置在染架上，玻片间距保持10mm以上的距离；火焰固定（在5秒钟内将玻片置于火焰上来回烤4次）。
⑵ 滴加石碳酸复红染液，盖满痰膜，火焰加热至出现蒸汽后，脱离火焰，保持染5分钟。染期间应始终保持痰膜被染液覆盖，必要时可续加染液。加温时勿使染沸腾。
⑶ 流水自玻片一端缓冲洗，冲去染液，沥去标本上剩余的水。
⑷ 自痰膜上端外缘滴加脱剂布满痰膜，脱1分钟；如有必要，需流水洗去脱液后，再次脱至痰膜无可视红为止。
⑸ 流水自玻片一端轻缓冲洗，冲去脱液，沥去玻片上剩余的水。
⑹ 滴加亚甲蓝复染液，染30—60秒钟。
⑺ 流水自玻片一端轻缓冲洗，冲去复染液，然后疬去标本上剩余的水，待玻片干燥后镜检。
一张染合格的玻片，由于被亚甲蓝染而呈亮蓝。将染后的玻片放置在报纸上，如果透过痰膜不能分辩报纸上的文字，表明该玻片涂抹过厚。
5.4镜检读片:
萋—尼氏染玻片镜检
使用10X目镜双目显微镜读片。取染完毕且已干燥的玻片，痰膜向上放置在玻片台上并以卡尺固定。首先使用40X物镜，转动卡尺移动玻片至痰膜左端，将光线调节至适当亮度，
调节焦距至可见细胞形态；移开40X物镜，在玻片上滴1-2滴镜油，使用100X油镜进行细致观察。在淡蓝背景下，抗酸菌呈红，其他细菌和细胞呈蓝。为防止AEB交叉感染，严禁油镜镜头直接接触玻片上的痰膜。
读片时，首先应从左向右观察相邻的视野，当玻片移动至痰膜一端时，纵向向下转换一个视野，然后从右向左观察，依此类推。通常10mmX20mm的痰膜，使用100X油镜，每行可观察100个视野。
仔细观察完300个视野，一般需要5分钟以上。一位镜检人员连续阅读10—12张玻片后应休息约20分钟。
5.5镜检结果报告:
由于与疾病传染性的程度及其相应严重程度密切相关，故镜检时发现细菌的数量是非常重要的参考依据。因此痰涂片镜检的结果报告，不仅是对疾病的定性，也是对疾病严重程度的半定量。
衰变池5.51萋□尼氏染 镜检结果分级报告标准
抗酸杆菌阴性㈠：连续观察300个不同视野，未发现抗酸杆菌。
报告抗酸杆菌菌数：1-8条/300视野。
抗酸杆菌阳性(1+)：3-9条/100视野。
抗酸杆菌阳性(2+)：1-9条/10视野。
抗酸杆菌阳性(3+)：1-9条/每视野。
抗酸杆菌阳性(4+)：≥10条/每视野。
5.52登记报告
（1）登记前应对检验单、标本盒、涂片上的标注进行反复核对。
（2）检查后的每一张涂片结果，应按规定准确记录在“结核病细菌学实验登记本”上。
（3）镜检结果报告应及时发出，以便尽早为临床提供诊断论据。
5.6抗酸染玻片的保存
（1）阅读完萋尼氏染玻片后，应及时用染满二甲苯（分析纯）的擦镜纸揭取数次，彻底去除玻片上的镜油。
（2）经脱油、干燥的玻片，必须再次核对实验室登记本与每张涂片实验序号
（3）涂片上严禁标记镜检的阴阳性结果。
（4）全部涂片按实验室登记本序号排列放置在玻片盒中.
(5)涂片保存与实验室登记本记录应保持一致。初诊病人第1张涂片存入涂片盒后需预留出2个空位置，以备第2张、第3张涂片检查放入；随仿病人第1张涂片存入涂片盒中后需预留出1个空位置，以备第2张涂片检查后放入。
(6)按规定数量保存的用于室间质量评估的痰片，未经上级质控单位准许不能自行销毁
(7)装满涂片的玻片盒，存放在阴凉干燥的环境中，需用标签注明涂片实验序号区间和日期区间，以便日后盲法复检或现场评价时抽样
6、 废弃标本及污染物的处理
1）废弃标本、痰盒和污染物均须经高压蒸汽灭菌方能丢弃或清洗；严禁不经灭菌随意处理。
2）如需焚烧处理，须置于焚烧炉内彻底焚化。焚化不彻底或暴露焚烧是危险的。
3）试验操作工作面应以3%石碳酸或其它可靠的清毒液擦拭后，再用紫外线灭菌灯（距离1m）照射30分钟以上。
7、抗酸染镜检注意事项
7.1 AFB痰检假阳性结果的预防措施
⑴ 必须使用新的载玻片进行相应的检查。
⑵ 每个标本均使用一个新竹签完成制片涂抹。
⑶ 所有染液均经过滤。
⑷ 染时玻片彼此保持一定距离，相互彻底分隔开。
⑸ 严禁使用染缸染。
⑹ 染时勿使玻片上的染液干燥。
⑺ 滴加镜油时，严禁容器滴口直接接触玻片痰膜。
⑻ 严禁物镜镜头直接接触玻片上的痰膜。
⑼ 完整、准确地标注痰盒、玻片和登记实验室登记本。
⑽ 登记前、后对检验单和标本盒上的标注进行仔细核对。
⑾ 准确记录和报告结果。
7.2 AFB痰检假阳性结果的预防措施
⑴ 确认标本是痰而非唾液。
⑵ 确认每份标本至少有3ml。
⑶ 选择脓样、干酪样、黏液分泌物涂抹制备玻片。
⑷ 制备玻片时标本涂抹均匀，不要太厚或太薄。
⑸ 使用高质量染料，严格按照配方配制染液。
⑹ 严格按照操作程序完成染过程。
⑺ 判断结果为“阴性”前，须阅读规定要求的视野数。
⑻ 作为对照，可采用已知结果为阳性的玻片，完成染镜检过程。
⑼ 完整、准确地标注痰盒、玻片和实验室登记本。
⑽ 登记前仔细核对检验单和标本盒上的标注。
⑾ 准确记录和报告结果。
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