随着人类基因组计划（HGP）的完成，蛋白质组计划也已经启动，基因序列数据、蛋白序列和功能数据以惊人的速度增长，而传统的生物技术已经不能满足数据倍增的要求，生命科学需要更快捷、更准确的自动化的生物技术，而生物芯片在这种情况下应运而生。 1 的进展和种类
生物芯片（biochip）的概念虽源于计算机芯片但不同于计算机芯片。狭义的生物芯片即微阵列芯片，主要包括cDNA微阵列、寡核苷酸微阵列、蛋白质微阵列和小分子化合物微阵列。分析的基本单位是在一定尺寸的基片（如硅片、玻璃、塑料等）表面以点阵方式固定的一系列可寻址的识别分子，点阵中每一个点都可以视为一个传感器的探头。芯片表面固定的分子在一定的条件下与被检测物进行反应，其结果利用化学荧光法、酶标法、同位素法或电化学法显示，再用扫描仪等仪器记录，最后通过专门的计算机软件进行分析。而广义的生物芯片是指能对生物成分或生物分子进行快速并行处理和分析的厘米见方的固体薄型器件[1]。 1996年美国Affymetrix公司将芯片光刻技术与光化学合成技术相结合制作了寡核苷酸微阵列芯片，即世界上第一种生物芯片[2]。自此之后，各种类型的生物芯片相继产生。生物芯片根据性能不同又可分为两类六种，既信息芯片和功能芯片，其中信息芯片根据芯片上固定的探针不同（载体材料不同）分为基因芯片、蛋白质芯片、细胞芯片、组织芯片；而功能芯片根据结构和功能特点分为微流体芯片和芯片实验室（Lab-on-a-chip）。最近，就出现了一种被
生物芯片技术及其在临床检验医学中的应用进展
李喜莹1 李珊珊2★
[摘 要] 生物芯片技术是一项发展迅猛的高新技术，其在医学领域有很重要的应用价值，为现代医
学科学及医学诊断学的发展提供了强有力的工具。特别是在临床检验医学方面，生物芯片技术已经被应
用于病毒/细菌的检测，自身免疫疾病的免疫标志物的检测，遗传性疾病的检测及肿瘤免疫标志物的单一
检测及其联合检测等方面。在不久的将来，生物芯片技术将在临床检验医学中发挥更大的作用。
[关键词] 生物芯片；感染性疾病；自身免疫性疾病；遗传性疾病；肿瘤性疾病
The biochip technology and its application in clinical laboratory medicine research
LI Xiying1, LI Shanshan2★
(1.Department of Blood Transfusion, Cancer Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences, Beijin
g 100210,
China; 2. Department of Clinical Laboratory, Tongzhou Blood Center of Beijing, Beijing, 101100, China)
四球机[ABSTRACT] The biochip technology is a rapidly developing high technique. It plays an important
如何自制夹蛋器role in the application to medical field, especially to clinical laboratory medicine research. The technique has
been applied in the fields of screens and detections study such as the infection of virus/ bacterial and autoimmune
markers, diagnosis and gene expression profile analysis of genetic diseases and simple or combined detection
of tumor markers. In near future, the biochip technique will inevitably play a more important role in clinical
laboratory medicine research.
[KEY WORDS] Biochip technology; Infectious disease; Autoimmune disease; Genetic disease; Tumor disease
作者单位：1.中国医学科学院肿瘤医院输血科，北京100210
2.北京市通州区中心血站检验科，北京101100
★通讯作者：李珊珊，E-mail：lishanshan8010@yahoo
•综述•
硅棒称为膜片钳芯片（patch-on-a-chip）的新技术，芯片上的一个点就可以实现传统膜片钳技术的功能。芯片实验室的构建是生物芯片研究的一个新的阶段，是生物芯片技术发展的最终目标。它可以将样品的制备、生化反应到检测分析的整个过程集成化形成微型分析系统[1]。
生物芯片技术是融微电子学、生物学、物理学、化学、计算机科学为一体的高度交叉的新技术，具有重大的基础研究价值，又具有明显的产业化前景。经过十多年发展，生物芯片技术已日臻完善，其应用前景非常广阔，因其具有技术操作简易、自动化程度高、检测目的分子数量多、高通量等特点，为“后基因组计划”时期基因功能的研究及现代医学科学及医学诊断学的发展提供了强有力的工具。
2 感染性疾病诊断应用
感染性疾病多是由于病毒或细菌的感染引起的。除了理解感染性疾病的发病机制之外，临床上检测病毒/细菌其相应的免疫标志物在人体中的存在，对病因诊断与意义重大，但传统检测的方法，如ELISA费用高且费时。生物芯片技术的引入，则大大加快了检测效率和准确性。
由乙肝病毒（HBV）、丙肝病毒（HCV）引起的病毒性肝炎是全世界主要的公共健康问题。Zhang 等[3]构建包括5种重组HCV抗原（核，NS3，NS4和NS5抗原等）和白介素-1（IL-1）的蛋白芯片，能够同时检测出不同的HCV抗体。与ELISA技术相比具有较高的敏感性和特异性；且易操作、低成本，非常适用于体外HCV抗体的检测。Duan等[4]用纳金免疫扩增和银染为基础构建的蛋白芯片可以同时快速地检测HBV和HCV的相应抗体HBsAb、HBeAb、HBcAb和HCV Ab，而且不存在交叉反应，结果与ELISA检测的结果无显著差异。而且芯片技术引入光学生物传感器技术，突破了常规ELISA 技术所采用的底物显方法。Ivanov等[5]首次应用IAsys+双通道光学生物传感芯片，记录固定在生物传感芯片上的抗HBs单抗与血清样本中的HBsAg的相互作用，从而对乙型肝炎表面抗原进行鉴别。与酶免疫技术对比，它具有灵敏度高、特异性好的特点。
除免疫标志物等指标外，还应明确病毒的核酸结构和体液病毒核酸的含量，作为遴选抗病毒药物，评价临床疗效，明确发病机制的指标之一。目前多采用DNA测序、PCR等方法，因其技术难度和实验成本而限制了应用。基因芯片技术是一种高通量的基因检测与分析方法，通过芯片上集成的大量探针对样品的基因进行平行检测。通过集成多种肝炎病毒的基因探针于基因芯片上，从基因的角度来对病原
体进行快速诊断、鉴别诊断与基因分型[6]。虽然PCR技术已经广泛应用扩增样本中小量DNA以便进行基因分析，但疾病的分子诊断和细菌耐药检测都急需快速并准确的扩增技术。而微小芯片实时PCR系统（real-time micro-scale chip-based PCR system），仅包括6个独立控制PCR过程的温度循环模式，体系仅为1 μL，且仅20 min就可以完成40个循环。对563例临床样本检测HBV，灵敏度可以达到94%，特异性达到93%，弥补了传统PCR技术时间长的不足[7]。
此外，目前临床上急需一种在感染性疾病爆发初期能快速而准确检测并鉴定其病原体的方法。而且这种检测病原体的技术必须具有物种广泛性和物种特异性。根据基因芯片的敏感性、速度和成本，可以取代TaqMan PCR技术检测HIV病毒[8]。常规的检测小孢子虫技术费时、不敏感，只是试图验证其是否存在。但由于小孢子虫体积小、形态学相似，很多时候无法分辨其种类。Wang等[9]建立的寡核苷酸芯片同时检测并鉴定4种不同的小孢子虫。其高通量和准确鉴别的特点，有利于临床诊断和流行病学调查。
常规的结核分支杆菌的培养条件要求极其严格，又因其生长周期缓慢给临床上的鉴别带来诸多不便。Park等[10]建立的寡核苷酸微阵列，能够同时鉴别出MAC，M. fortuitum，M. chelonae，M. abscessus等20种不同的结核杆菌菌属，而且整个操作过程完全可以在普通实验室进行，且从DNA提取，PCR扩增，DNA杂交到扫描整个过程完成，仅需要4.5 h，这将使临床诊断的效率极大的提高。
对于病毒感染性疾病的，主要使用一些抗病毒/菌药物，而芯片技术也为抗病毒/菌药物的作用机理、作用靶位和耐药性的分析提供了基因学角度的解释，从而解决病毒/菌产生耐药的问题。Denkin[11]建立了水杨酸处理结核分枝杆菌的表达谱芯片，来解释水杨酸抗结核的基因机制。结核分支杆菌标志性耐药检测联合芯片可以同时检测（INH）（抗结核药）和利福平（RIF）（抗结核药）后结核分支杆菌相关的基因突变，分别为84.1%的INH处理菌中检测到KATG315和INHA15发生突变；100%
的 RIF处理菌中检测到RPOB511、RPOB513、RPOB516、RPOB522、RPOB526、RPOB531和RPOB533发生突变。这些突变的基因位点可能就是药物作用的靶点[12]。
3 自身免疫性疾病诊断应用
自身免疫性疾病是一种机制未明的疾病，其发病机制可能与遗传、免疫、环境、病毒感染等因素有关。生物技术通过基因以及蛋白的变化来分析各种自身免疫疾病，为临床的诊断提供了新途径，并且为开发新的药物提供了新的靶点和信息。
类风湿性关节炎（RA）是一种较为常见的自身免疫疾病，临床上主要通过对患者血清中的类风湿因子（RF）、抗环瓜氨酸多肽（CCP）抗体、抗角蛋白抗体（AKA）和抗RA33抗体的单一或联合检测，辅助类风湿性关节炎的诊断。Osteopontin（OPN）是一种具有基因多效性的细胞外基质蛋白，Xu等[
13]通过生物芯片等技术首次发现滑膜T细胞中OPN过度表达与局部炎症有关，而且OPN在类风湿性关节炎炎症扩大和保持发挥重要作用，OPN可能将是一种新的类风湿关节炎的标志物。而Schmutz等[14]通过分析类风湿性关节炎的趋化因子受体CXCR5的基因芯片，发现其在类风湿性关节炎的患者体内的水平上调，说明非炎性受体CXCR5及其配体可能在类风湿性关节炎的发病机制中发挥重要作用。
原发性胆汁性肝硬化（PBC）是一种进行性自身免疫病，其分子机制至今不清。Honda等[15]利用不同病程阶段的活检切片的基因表达谱分析，得出原发性胆汁性肝硬化I期的基因表达情况与其他期Ⅱ，Ⅲ不同，为原发性胆汁性肝硬化的病因学和疾病的发展提供了新线索。
对于广大临床检验医生来说多通过检测自身抗体来分析自身免疫疾病，但临床上要求对单个样本进行多种自身抗体的检测才能证实为某种自身免疫性疾病。Feng等[16]构建了包括SSA 52、SSA 60、SSB和Jo-1等15种自身抗原的蛋白芯片，来检测类风湿性关节炎等自身免疫疾病，且结果与传统方法的结果相似。
而同样的联合检测方法也应用于I型变态反应的变应原的检测。临床上多进行皮肤刺激实验和使用变应原提取物进行IgE血清学分析。但这只能鉴定出变应原的大体成分，无法确定引起疾病的变应原分子。Hiller等[17]构建了包括绝大多数常见变应原的94种纯化的变应原分子的芯片，这种芯片仅用微量血清并进行单次实验即可检测出引起疾病的多种变应原的IgE反应谱。Kim等[18]构建了包括纯化的人类IgE
（阳性对照）、尘螨、蛋青、大豆和小麦（4种变应原）及人类血清白蛋白（阴性对照）的一种蛋白芯片，而且通过定量测量来评价蛋白芯片，通过免疫荧光技术来评价多种变应原特异性IgE的灵敏度的限制性。
生物芯片技术同样也应用到自身免疫病的新药开发和研制方面。如Feferman[19]将生物芯片技术应用到确定重症肌无力的新药物靶点，以来减少目前所使用的非特异性免疫抑制剂的需要。而应用DNA芯片分析系统性红斑狼疮的基因表达，发现干扰素调节基因在其患者的外周血和肾神经纤维球中的表达过度，为寻求的新靶点提供了新的角度[20]。此外，Hsu等[21]将人类原代表皮角化细胞和人类唾液腺泡细胞经绿茶多酚处理，并分析其cDNA 表达芯片情况，发现绿茶多酚能够抑制主要自身抗原的转录和翻译，包括SS-B/La、SS-A/Ro、DNA拓扑异构酶I等。同时绿茶本身又具有抗炎症和抗凋亡的作用，绿茶多酚可能将是抗自身免疫病的重要成分，将有利于自身免疫病的和早期预防。康志坚
4 遗传性疾病诊断应用
在近10~15年快速发展中，分子生物技术对高通量的检测和诊断产生了直接的影响，包括临床上常见血液分型。生物芯片技术将替代以往的大量单样本检测技术，在第一时间提供全部供者及受者测试的完整平台。而目前临床上多通过血细胞凝集反应对血型抗原分型。这种方法所用的试剂昂贵，缺乏实
用性，而且方法比较费力。而通过芯片进行大规模DNA分析来进行血型分型，即快速又经济[22，23]。
对于器官移植的组织配型，免疫反应的研究和疾病相关调查，仅血型分析是不够的，了解精确的HLA 等位基因匹配和序列变异是十分必要的。而生物芯片技术是一种简单、快速并精确的HLA多态性的分型方法，对于疾病的易感性、组织的移植、个体的分辨以及人类学的基因组的研究领域将有非常重大的意义。
Erlich等[24]通过寡核苷酸芯片技术进行HLA的
分型，与以往检测只简单将其分辨出来不同的是这种分析方法揭示出两个等位基因在哪并如何不同而且节约成本。通过对外显子2和3所有的基因多态性进行详细的分析得出HLA-I型的复杂性。如Guo等[25]将寡核苷酸芯片技术应用于HLA-B等位基因的分型，设计的寡核苷酸探针代表了所有已知HLA-B的外显子2和3的多态性。通过以人类基因组DNA 为模板，以带有荧光标记的寡核苷酸为引物，将外显子2和3扩增，并与固定好的基片杂交，通过荧光扫描分辨出阳性杂交。根据杂交形式的定量分析来标记HLA-B的等位基因。
HLA是重要的免疫源性系统。其在免疫应答和造血干细胞和器官移植方面发挥重要作用。分子生物学技术和HLA分型技术的联合应用，改善了HLA 分型的准确性和可操作性，能够快速并准确地分析疾病
的基因变异。Hoppe等[26]通过寡核苷酸芯片技术分析北非镰状细胞血症男性患者HLA的分型情况，发现一种新的HLA-B等位基因，即HLA-B*5613，且与B*5601相匹配但只在密码子180的一个亚基不同。
除了DNA芯片技术之外，一种将常规的毛细血管电泳缩微芯片上的新技术－毛细血管电泳芯片也应用于HLA分型。如HLA-H是诊断遗传性血素沉着病的主要基因，Wooley等[27]通过毛细血管电泳芯片对生物相关样本进行同时并快速的HLA-H的基因分型，可以同时对12种不同的样本进行快速的分析，且分析时间低于160 s。由此可见利用毛细血管电泳芯片能快速高通量的进行HLA分型是可行的。
5 肿瘤性疾病诊断应用
肿瘤性疾病一直以来是学者们关注的焦点，基因变异是否影响肿瘤形成，是否有新的肿瘤标志物，是否能到抗肿瘤新药的作用靶点等，一直是人们试图解决问题的关键。
p53基因家族的异常表达与肿瘤的发展有关。Zhu等[28]使用组织芯片研究肝细胞癌和癌旁组织中8种p53致癌基因和抑癌基因p16（INK4a），p21（WAF1），p33（ING1b），p53，p57（KIP2），p73，MDM2和ATM的表达差异性和临床病原学意义。组织芯片具有同时检测样本多，检测靶基因多和操作时间短的特点，并通过免疫组化技术检测其表达，有利于高通量检测肝细胞癌相关的致癌基因和抑癌基因。病毒感染也与肿瘤的发生有关。Wang等[29]构建一种组织芯片检测肝细胞癌组织和癌旁
组织中乙型肝炎病毒表面抗原 HbsAg的表达情况。结果发现HbsAg阴性的癌组织与HBV DNA的插入直接相关，提供了研究HbsAg对肝细胞癌影响的新视角。
肿瘤标志物一直是检测癌症的依据，但没有一种单一的肿瘤标志物的敏感性和特异性能达到临床严格的诊断标准。常规上，临床会检测多个肿瘤标志物项目，但其费时费力，并给患者增添经济压力。而由肿瘤标志物构建的蛋白芯片则同时可以检测多种标志物。Sun等[30]将12种肿瘤标志物CA125、CA15-3、CA19-9、CA242、CEA、AFP、PSA、F-PSA、HGH、β-HCG、NSE和铁蛋白的相应单克隆抗体固定于芯片表面，其能够捕获血清样本中的相应抗原，并加入带有荧光的二抗，根据荧光信号来检测结果。其可以检测肝癌、胰腺癌、膀胱癌和胃肠癌症的肿瘤标志物，有利于肿瘤的诊断和对癌症危险人的研究调查。同时，应用DNA表达谱芯片可以根据表达基因或蛋白的差异分析得到新的肿瘤标志物，如Tsunedomi等[31]应用细胞素P450（CYP）的表达谱芯片，发现肝细胞癌的CYP2B6、CYP-IIC、CYP2C9，CYP2C19、CYP3A5、CYP4F3和CYP27A1的水平显著降低；肝细胞癌癌细胞浸润扩散与非浸润扩散相比较，CYP2E1和CYP4F2显著降低，CYP-IIC和CYP2C9的水平与肿瘤体积成负相关，CYP51A1的水平与肿瘤体积成正相关。这些CYP可以作为判断肝细胞癌进展的指标和肝细胞癌的分子标志。而Smith等[32]以20例HCV感染的肝细胞癌和非肝细胞癌为基础，构建cDNA芯片，在13 600个基因当中，50个基因可以作为肝细胞癌的标志基因，在肝细胞癌中这些基因表达水平上调，且比传统临床应用的标志物的范围宽。其中包括一些肿瘤相关基因如丝氨酸/苏氨酸
激酶15 （STK15），还有血浆谷氨酸酯羧肽酶（PGCP）和分泌性磷脂酶A2（PLA2G13和PLA2G7）在半数以上的样品中水平上调，可以作为肝细胞癌的血清学标志物。
6 国内外应用
生物芯片作为生物信息学的主要技术支撑和操作平台，其有着广阔的发展空间，又具有明显的产业化前景。所以自1996年美国Affymetrix公司成功
地制作出世界上首批用于药物筛选和实验室试验用的生物芯片，并制作出芯片系统，此后世界各国在芯片研究方面快速前进，不断有新的突破。美国的Hyseq公司、Syntexi公司、Nanogen公司、Incyte 公司及日本、欧洲各国都积极开展DNA芯片研究工作；摩托罗拉、惠普、IBM等跨国公司也相继投以巨资开展芯片研究。2003年，罗氏公司已有两款与药物代谢有关的基因芯片获得美国医药最高官方机构食品和药物管理局（FDA）批准； 2004年12月，美国FDA 核准Roche Molecular Systems公司的AmpliChip CYP450基因型检测产品上市，成为第一个获得FDA认定为体外诊断医疗器材的基因芯片；而基于MASA“液态芯片”技术的AtheNA Multi-Lyte芯片已由美国Zeus Scientific公司成功开发并通过美国FDA临床批准通过。
我国的生物芯片技术产业也在蓬勃发展，2000年9月30日，以清华大学为主要发起人，联合华中科技大学、中国医学科学院和军事医学科学院等三家科研单位共同成立生物芯片北京国家工程研究中心；
2000年国际生物芯片技术大会于10月11~14日在北京召开，这又是对我国生物芯片技术发展的促进；而且2003年10月深圳市微芯生物科技有限责任公司与美国FDA毒理研究国家中心签署了共同开发美国用于药理研究及毒理研究的表达谱生物芯片及其信息分析平台的协议，这是美国FDA在全球范围内首次与中国的生物企业进行合作。
7 小结
人类基因组计划是人类为了认识自己而进行的一项伟大而影响深远的研究计划。目前的问题是面对大量的基因或基因片断序列如何研究其功能，只有知道其功能才能真正体现HGP计划的价值。而后基因组计划、蛋白组计划、疾病基因组计划等概念就是为实现这一目标而提出的。因此我们需要从更高的层次全面的理解这种相互关系，全面了解不同个体基因变异、不同组织、不同时间、不同生命状态等的基因表达差异信息，并出其中规律。生物芯片技术就是为实现这一环节而建立的，使对个体生物信息进行高速、并行采集和分析成为可能。而且生物芯片由于具有高通量（或超高通量）、并行性、低消耗、微型化、自动化的特点，将尤其适合于大量临床样本检测和药品的研究与开发等医疗项目。它将为人类认识生命的起源、遗传、发育与进化、为人类疾病的诊断、和防治开辟全新的途径。
但在现阶段生物芯片技术仍存在一些亟待解决的问题，如该技术需要昂贵的设备、成本较高，且其特异性、灵敏度以及集成度都有待提高。而且随着生物芯片技术研发应用急剧增加，由此而带来繁多泛
滥的数据，需要研究人员去分析、利用和比较它们，而且不同的研究人员所使用的技术平台和不同的方法，没有一个标准化的尺度，就很难将这些结果统一起来，无法评定结果的可靠性。所以这种技术急需一个国际通用的评定标准，并能够在与常规的方法比较的标准下体现其优点。但我们相信生物芯片技术在不断的完善和改进中，必将成为深入认识以及理解人类生命、疾病的重要工具。
参考文献
[1] 徐炳森, 邵健忠. 几种新型生物芯片的研究进展[J]. 生物化
光触媒仿真花学与生物物理进展, 2000, 27(3): 251-253.
[2] Editorial. To affinity……and beyond[J]. Nat Genet, 1996,
14(4): 367.
[3] Zhang W, Huang J, Zhou M F, et al. Protein chip for
detection of different HCV antibodies: preparation, quality control, and clinical evaluation[J]. Mol Diagn, 2005, 9(2): 81-87.
点火装置[4] Duan L, Wang Y, Li S S, et al. Rapid and simultaneous
detection of human hepatitis B virus and hepatitis C virus antibodies based on a protein chip assay using nano-gold immunological amplification and silver staining method[J].
BMC Infect Dis, 2005, 5: 53.
[5] Ivanov luD, Gnedenko O V, Nikolaeva L I, et al. Detection
of hepatitis B virus surface antigen with the use of an optical biosensor[J]. Zh Mikrobiol Epidemiol Immunobiol, 2003,
(2): 58-62.
[6] 孙朝晖, 马文丽, 郑文岭. 基因芯片诊断病毒性乙型、丙型
肝炎[J]. 解放军医学杂志, 2003, 28: 375-376.
[7] Cho Y K, Kim J, Lee Y, et al. Clinical evaluation of micro-
scale chip-based PCR system for rapid detection of hepatitis
B virus[J]. Biosens Bioelectron, 2006, 21(11): 2161-2169.
[8] Gardner S N, Kuczmarski T A, Vitalis E A, et al. Limitations
of TaqMan PCR for detecting divergent viral pathogens illustrated by hepatitis A, B, C, and E viruses and human immunodeficiency virus[J]. J Clin Microbiol, 2003, 41(6):
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
关于我们
投诉建议