第27卷2期2021年3月
105
天津医科大学学报
Journal of Tianjin Medical University
Vol. 27, No. 2Mar. 2021
文章编号 1006-8147(2021)02-0105-04 亠 _
刘瑞琪，刘凡，贾智
(天津医科大学口腔医院综合科，天津300070)
摘要 目的：探究维生素C 对牙周膜干细胞组蛋白去乙酰化酶(HDAC )1和HDAC6表达的影响。方法：收取临床上因正畸需要
拔除的无K 坏前磨牙，分离并培养人牙周膜干细胞。流式细胞仪测定牙周膜干细胞表面标志物。qPCR 检测添加5、20、/0、320
mmol/L 维生素C 后，人牙周膜干细胞中HDAC1和HDAC6 oRNA 的表达情况。结果：维生素C 促进HDAC1 ()二45.76,*:0.01)、 HD+C6()=119, P<0.01)的表达，且随着浓度的增加，HDACl d HDAC6表达显著增加。结论：维生素C 促进牙周膜干细胞中 HDAC1 和 HDAC6 表达。
关键词 组蛋白去乙酰化酶；人牙周膜干细胞；维生素C ;HDAC1;HDAC6
中图分类号R781.4 文献标志码 A
Vitamin C affects the expression of HDAC1 and HDAC6 in periodontal ligament stem cells
LIURui-qi,LIUFan,JIA Zhi
(Department of Endodontics ,Stomatology Hospital, Tianjin Medical University,Tianjin 300070, China )
Abstract Objective ： To reveal the effects of vitamin C on the expression of HDA C1 and HDA C6 mRNA in periodontal ligament stem
cells. Methods ： Human periodontal ligament stem cells were isolated and cultured from caries free premolars. Determination of surface
markers of periodontal ligament stem cells by flow cytometry. qPCR was used to analyze the expression of HDAC1 and HDAC6 mRNA in human periodontal ligament stem cells treated with different concentrations of vitamin C ( 5,20,80,320 mmol/L ). Results : Vitamin C
promoted the expression of HDA C1 and HDA C6, and the expression of HDA C1 ( )=45.76, *<0.01) and HDA C6( )=119, *<0.01) increased significantly with the increase of vitamin C concentration. Conclusion ： The results of the experiment indicate that vitamin C promotes the expression of HDAC1 and HDAC6 in periodontal ligament stem cells.
Key words histone deacetylase ; human periodontal ligament stem cells ; vitamin C ; HDA C1; HDA C6
维生素C 是生物合成细胞外基质所必需的，也 是模拟间充质干细胞体内生理环境及调节其增殖 和分化所必需的。已有研究表明，维生素C 能够维 持肝癌细胞端粒酶活性，促进细胞外基质和干细胞 标志物的表达叭牙源性间充质干细胞是口腔颌面 部组织再生的主要来源，有较好的潜力〔1。炎
症、缺氧等微环境对牙周膜干细胞介导的组织再生
具有不容忽视的调节作用〔“。在先前研究中发现， 根尖牙乳头间充质干细胞中维生素c 促进组蛋白 去甲基化酶KDM2B 和KDM5C 的表达艮 目前维生 素C 对去乙酰化酶表达的影响尚不清楚，其对间充
质干细胞衰老调节的机制需要进一步探讨。本研究拟
通过使用不同浓度的维生素C 处理牙周膜干细胞，检
测牙周膜干细胞中组蛋白去乙酰化酶（HDAC ）和 HDA C6 mRNA 的表达情况，以探究维生素C 对牙 周膜干细胞生物学特性的影响。
作者简介刘瑞琪（1994-），硕士在读，研究方向：口腔内科学及口腔细 胞分子生物学；通信作者：贾智,E-'ail: jiazhi0 962@lu 。
1材料和方法1.1
主要试剂和实验用品 a -MEM 培养基（Sig -
ma，美国）;PBS （Gibco，美国）;Trizol 试剂（Invitrogen
公司，美国）；细胞培养瓶、培养板（CORNING 公司, 美国）;0.25%胰蛋白酶-EDTA 消化液（Solarbio ，中 国）；双抗（链霉素、青霉素,Life ，美国）；优质胎牛血
清（FBS,Gibco ，澳大利亚）；中性酶（Dispase 2, Sig - ma，美国）；I 型胶原酶（Sigma ，美国）；维生素C
（Sigma ，美国）;cDNA 第一链合成试剂盒，荧光定量
检测试剂盒（TIANGEN ）。1.2沉砂池
实验方法
1.2.1牙周膜干细胞的分离培养经天津医科大 学口腔医院伦理委员会批准（TMUhMEC04），患者
知情同意。收取临床上因正畸需要拔除的无龋坏前 磨牙（13+26周岁，患者身体健康）。将收集的牙齿置
于含有双抗的PBS 离心管中，进行高浓度至低浓度
的梯度冲洗，依次为20%（1 mL PBS +200 #L 双抗）、 10%（1 mL PBS +100 #L 双抗）、5%（1 mL PBS +50 #L
106夭津医科大学学报第27卷
双抗）、0%（1mL PBS）的双抗溶液，取根中1/3牙周膜组织，随后将牙周组织置入200^L PBS液滴之中，剪碎至小于1mm!l mm碎块。将剪碎的组织块放入15mL离心管中，加入2mL中性酶+I型胶原酶（1：1）配成的混合溶液，每10min震荡1次，消化时间小于1h，至牙周组织絮状沉淀完全消化至澄清，1000r/min离心5min后，去除上清，用1 mL含152FBS的#-MEM培养基重悬，将细胞置于无菌培养瓶中，1周后将培养基换成含10%FBS的$-MEM，待细胞密度长至70%〜80%左右进行传代。本研究选用第3代牙周膜干细胞进行实验。使用不同剂量的维生素C（5、20、80、320mmol/L）刺激牙周膜干细胞，分别在0、1、12、24h收取细胞。
1.2.2流式细胞术检测牙周膜干细胞表面标志物选取第3代牙周膜干细胞进行实验，PBS洗涤细胞2次，加入胰酶消化3min。终止消化，吹打混匀，1000r/min离心5min，去除上清液，用PBS 重悬细胞，转移至1.5mL EP管中，离心弃上清。用 PBS重悬细胞。随后加入（fitc）stro-1一抗，室温下孵育30min,1000r/min，离心5min，弃上清用PBS重悬，随后再次离心弃上清，用200^L PBS重悬后避光加入二抗30min。将荧光素异硫氧酸酯（PE）-CD45、（FITC）-CD90、藻红蛋白（PE）-CD146抗体加入不同组分的牙周膜干细胞中，在室温下孵育30min。用流式细胞仪测定细胞STRO-1、CD45、CD146和CD90阳性染百分比。
1.2.3实时定量荧光PCR将不同时间、不同浓度维生素C处理的牙周膜干细胞，弃培养基,PBS冲洗，按照细胞密度加入1mL Trizol细胞裂解液，裂解5min。随后，收集至1.5mL离心管中每个EP管中力口入1/5Trizol体积的氯仿，轻轻混匀后静置10min, 4#12000r/min离心15min。待离心结束后，将最上层的水相吸出，加入等体积异丙醇溶液，混匀并静置10min,4#12000r/min离心10min，弃去上清，向沉淀中加入75%的酒精,4#12000r/min离 心10min，弃除上清，干燥后加入30叭无酶水溶解。用Nanodrop测量仪测量RNA浓度及纯度。反转录：取1^L RNA,2^L5x DNA Buffer,DEPC水补齐至10^L，混匀后，离心，置于PCR仪,42#孵育6min，置于冰上。每个样本中加入2|nL10x Fast RT Buffer,1|nL RT Enzyme Mix,2|nL FQ-RT Primer Mix（引物序列见表1）,5^L DEPC水。置于PCR仪,42#孵育60min,95#孵育10min置于冰上。反应后得到cDNA。建立20!L反应体系，10|nL Fast Start Universal SYBR Green Master,1|nL 上游弓I物，1!L下游弓I物，1!L c DNA,7^L DEPC 水。设置反应条件：预变性95#15min；95#10s,60# 20s,72#20s,40个循环；95#30s,55#30s, 95#30s o通过循环数法2-AA ct计算HDA Cl、HDA C6的表达情况。
表1各基因引物序列
Tab1Sequence of each gene primer
引物(RT-qPCR)序列(5$!3$)产物大小HDAC1上游引物AGCCAAGAGAGTCAAAACAGA102bp HDACl
下游引物GGTCCATTCAGGCCAACT102bp HDAC6上游引物AAGCCTCACCGAATCCGAATGA154bp HDAC6下游引物CTGGGCGAATAGAACGCAAGAA154bp GAPDH上游引物GTCAGTGGTGGACCTGACCT413bp GAPDH下游引物AGGGGAGATTCAGTGTGGTG413bp 注:HDA Cl：组蛋白去乙酰化酶1;HDA C-：组蛋白去乙酰化酶6
1.3统计学处理采用GraphPadPrism7进行柱状图作图和统计分析。采用双因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1牙周膜干细胞表面标志物检测表面标志物检测结果显示,STRO-1、CD90和CD146为阳性表达,CD45为阴性表达（图1）。说明分离的细胞为牙周膜干细胞。
图1牙周膜干细胞表面标志物检测
Fig1Surface markers of periodontal ligament stem
cells
第2期刘瑞琪，等•维生素C对牙周膜干细胞中HDAC1和HDAC6表达的影响107
2.2实时定量荧光PCR q-PCR结果显示，在牙
周膜间充质干细胞中，5、20、/0、320mmol/L维生素
C促进HDAC）、HDAC6的表达，且随着浓度的增
力口，HDAC1（,645.76，&<0.01，图2）、HDAC（，二119,
&<0.01，图3）表达显著增高。
*
旳
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吳
V
N
H
2
维生素C("mol/L)
注:G：对照组;HDA C1：组蛋白去乙酰化酶1;**&<0.01
图2不同浓度维生素C处理牙周膜间充质干细胞后HDAC1的表达
Fig2Expression of H DAC1after treatment of periodontal ligament
mesenchymal stem cells with vitamin C at different concen
trations
*旳w r x
吳
V N H 2
—
G
1h智能婴儿床
—12h
—24h 维生素C（"mol/L）
竹炭纤维袜注:G：对照组;HDAC%：组蛋白去乙酰化酶6；**&<0.01
图3不同浓度维生素C处理牙周膜间充质干细胞后HDAC6的表达Fig3Expression of HDAC6after treatment of periodontal ligament mesenchymal stem cells with vitamin C at dif
ferent concentrations
3讨论
牙周膜干细胞具有自我更新和多向分化潜能，可为牙周再生等临床应用提供可靠的细胞来源。有研究表明，体外扩增小型猪自体牙周膜干细胞进行自体移植，对牙周炎的效果显著叫还发现由于牙周膜干细胞具有低免疫原性和显著的免疫抑制作用，异体移植同样可以修复缺损％进一步研究显示，
胰岛素样生长因子结合蛋白5修饰的间充质干细胞可以促进牙周组织再生，减轻猪牙周炎模型的局部炎症，并且没有任何免疫原性排斥反应：10；。但是缺氧、炎症会影响牙周膜干细胞的功能冋，衰老也会影响牙周膜干细胞的生物学功能、降低牙周膜干细胞的免疫原性[11]o如何为牙周膜干细胞更好的发挥作用提供一个适宜的微环境，以及怎样改善由于个体衰老带来的挑战是当前亟待解决的问题。
维生素C参与各种基本的代谢和信号传递过程，是一种有效的抗氧化剂，可减少活性氧水簇，也可作为抗衰老剂。有研究表明，抗坏血酸减少了衰老的间充质干细胞数量，降低了衰老间充质干细胞内活性氧簇水平以及衰老相关蛋白P16INK4?含量，并且抑制了丝氨酸-苏氨酸激酶/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白通路[12]o Notch信号通路在牙齿发育和与成熟牙齿相关的损伤组织的再生中起重要作用，Notch3在衰老干细胞中显著上调，添加维生素C能 抑制Notch3，从而延迟增殖停滞的开始并减少衰老的特征，如！-半乳糖苷酶和p21的表达[13]o维生素C可以下调促衰老途径，包括P53、FoxO、缺氧诱导因子等，这可能为恢复年轻的间充质干细胞表型提供另一个机制[14]o由此可见维生素可通过相关通路，抑制牙周膜干细胞的衰老。
本研究使用维生素C处理12h内HDAC1和HDAC6表达量增多，且具有显著性差异。但在24h 表达量较12h稍有下降，可能与培养基中维生素C 含量随培养时间的增加而减少有关。本研究表明维生素C促进了HDA C1和HDA C6的表达，可能影响牙周膜干细胞的转录状态。
本实验发现HDAC水平会随着维生素C的添加而增高，即去乙酰化增加o有研究表明，维生素C 是组蛋白去甲基化所必需的问。目前，对于维生素C 和HDAC的具体机制尚不清楚。以往的研究表明在牙周膜干细胞衰老过程中HDAC6的表达减少，HDA C6在牙周膜干细胞衰老过程中起重要作用，而且部分依赖于P27kip1乙酰化的调控[16]o一些学者发现阿尔兹海默症患者的HDAC1表达下调，一项动物研究发现，激活HDAC1可以改善老年鼠的认知能力[17]o总之,HDAC1和HDAC6表达降低与细胞衰老密切相关。
综上所述，维生素C促进了人牙周膜干细胞中HDAC1和HDAC6的表达，具有显著的抗衰老特性，在以往的研究中也显示HDA C1和HDA C6与衰老密切相关[16-17]o而维生素C对于牙周膜干细胞增殖、分化、免疫调节的影响的具体机制尚不清楚，仍需进一步研究。
参考文献：
[1]Wei F L,Qu C Y,Song T L,et al.Vitamin C treatment promotes mes
enchymal stem cell sheet formation and tissue regeneration by elevating telomerase activity"].J Cell Physiol,2012,227（9）:3216 [2]Gan L,Liu Y,Cui D,et al.Dental tissue-derived human mesenchy
mal stem cells and their potential in therapeutic application[J].J Cell Physiol，2020，2020（4）:1无压锅炉
（下转第146页
）
146天津医科大学学报第27卷
abdominal hypertension,capillary leak,and fluid balance卩].Ann Intensive Care,2012,2(Suppl1)：1
[8]Don B R,Kaysen G.Serum albumin：relationship to inflammation
and nutrition[J].Semin Dial,2004,17(6)：432
[9]Sharif S P,Friedmacher F,Amin A,et al.Low serum albumin con
centration predicts the need for surgical intervention in neonates with necrotizing enterocolitis[J].J Pediatr Surg,2020,55(12)：2625 [10]李志金，杨赞章，李善学•甲泼尼龙致低钾性麻痹2例[J]•医药导
报,2015,34(8)：1117
[11]Bowker R M,Yan X,De Plaen I G.Intestinal microcirculation and
necrotizing enterocolitis:the vascular endothelial growth factor sys-tem[J].Semin Fetal Neonatal Med,2018,23(6)：411
[12]陈发玲，徐伟珏，李龙至，等•不同病变范围新生儿坏死性小肠
结肠炎手术干预效果分析[J]•中华实用儿科临床杂志，2016, 31(23):1783
[13]王雪秋，陈师，郭露，等•新生儿坏死性小肠结肠炎与自发性肠
穿孔临床对比分析[J].临床儿科杂志,2018,36(11)：871[14]林宇，吴晓娟，黄文华，等.新生儿坏死性小肠结肠炎和先天性巨
结肠肠穿孔的鉴别诊断和[J].中华实用儿科临床杂志,019, 34(21):1645
[15]中华医学会小儿外科学分会新生儿学组.新生儿坏死性小肠结
肠炎小肠造痿术后临床专家共识[J]•中华小儿外科杂志,2016, 37(8):563
[16]吴书清，钟斌，刘辉，等.Bishop-Koop造痿术和双口造痿术在新
生儿坏死性小肠结肠炎中的疗效比较[J].临床小儿外科杂志, 2018,17(11)：835
[17]刘斌•新生儿坏死性小肠结肠炎外科诊疗进展[J]•中国普通外科dc-link
杂志,2015,24(10)：1463
[18]Hong C R,Han S M,Jaksic T.Surgical considerations for neonates
with necrotizing enterocolitis[J].Semin Fetal Neonatal Med,2018, 23(6):420
[19]Robinson J R,Rellinger E J,Hatch L D,et al.Surgical necrotizing
enterocolitis[J].Semin Perinatol,2017,41(1):70
(2020-08-06收稿)
(上接第107页)
[3]Tomokiyo A,Wada N,Maeda H.Periodontal ligament stem cells:
regenerative potency in periodontium[J].Stem Cells Dev,20!9, 28(15):1
[4]薛栋，蒋少云，邓嘉胤，等•牙龈吓咻单胞菌脂多糖对人牙周膜细
胞成骨分化能力的影响[J]・天津医科大学学报,2015,21(4)：299 [5]Xiao Z L,Han Y,Zhang Y,et al.Hypoxia-regulated human peri
odontal ligament cells via Wnt/0-catenin signaling pathway卩].
Medicine,2017,96(16)：6562
[6]Liu Y,Liu W,Hu C,et al.MiR-!7modulates osteogenic differentia
tion through a coherent feed-forward loop in mesenchymal stem cells isolated from periodontal ligaments of patients with periodontitis[J].
Stem Cells,2011,29(11)：1804
[7]王月君，刘大勇，范志朋，等•维生素C促进根尖牙乳头间充质干
细胞组蛋白去甲基化[J].口腔医学研究,2015,31(5):466
[8]Ding G,Liu Y, Wang W, et al.Allogeneic periodontal ligament stem
cell therapy for periodontitis in wine[J].Stem Cells,2010,28(10)：!829
[9]Liu Y, Zheng Y,Ding G,et al.Periodontal ligament stem cell-medi
ated treatment for priodontitis in miniature swine[J].Stem Cells, 2008,26(4)：1065
[10]Liu D Y,Wang Y U,Jia Z,et al.Demethylation of IGFBP5by histone
demethylase KDM6B promotes,esenchymal stem cell-mediated peri
odontal tissue regeneration by enhancing osteogenic differentiation and anti-inflammation potentials[J].Stem Cells,2015,33(8)：2523 [!!]Li X,Zhang B, Wang H,et al.The effect of aging on the biological and immunological characteristics of periodontal ligament stem cells[J].Stem Cell Res Ther,2020,1((1)：326
[12]杨孟恺.抗坏血酸调控骨髓间充质干细胞衰老的作用机制研
究[D].上海交通大学,2018
[13]Yang Y,Wang T, Zhang S,et al.Vitamin C alleviates the senescence
of periodontal ligament stem cells through inhibition of Notch3during long-term culture[J].Stem Cell Reports,2020,236(2):：237 [14]Li Y,Zhang W Z,Chang L,et al.Vitamin C alleviates aging
defects in a stem cell model for Werner syndrome[J].Protn Cell，2016(7):478
[!5]Gillberg L，Rskov A D，Liu M，et al.Vitamin C-a new player in regulation of the cancer epigenome[J].Semin Cancer Biol,20!8, 5!:59 [16]Li Q,Ma YS,Zhu YY,et al.Declined expression of histone deacety
lase6contributes to periodontal ligament stem cell aging[J].J Peri-odontol,2016,88(1)：12
[17]Pao P C,Patnaik D,Watson L A,et al.HDAC1modulates OGG1-
initiated oxidative DNA damage repair in the aging brain and Alzheimer#s disease[J].Nat Commun,2020,2020(11)：】
(2020-10-26收稿)碎花刀刀
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