操作方法
[A] 诱导突变基因（PCR反应）以待突变的质粒为模板，用设计的引物及Muta-direct™酶进行PCR扩增反应，诱导目的基因突变。 1. 设计点突变引物。
[注]参考引物设计指导
2. 准备模板质粒DNA
胶黏剂搅拌机
定时点火装置[注]用dam+型菌株（例如DH5α菌株）作为宿主菌。在end+型菌株中常有克隆数低的现象，但是对突变效率没有影响。提取质粒DNA时我们建议您使用本公司的质粒提纯试剂盒。
3. [选项]对照反应体系（50μl反应体系）
10×Reaction Buffer 5μl
pUC18 control plasmid（10ng/μl, total 20ng）2μl
Control primer mix（20pmol/μl）2μl
dNTP mixture（each 2.5mM）2μl
O 38μl ddH
2
Muta-direct™ Enzyme1μl
4. 样品反应体系（50μl反应体系）
10×Reaction Buffer 5μl
Sample plasmid（10ng/μl，total 20ng）2μl
Sample primer (F)（10pmol/μl）1μl
防砸玻璃
Sample primer (R)（10pmol/μl）1μl
dNTP mixture（each 2.5mM）2μl
ddH2O 38μl
Muta-direct™ Enzyme1μl
5. PCR反应条件
[注]按如下参数设置PCR扩增条件。
6. PCR扩增反应完成后冰育5分钟，然后置于室温（避免反复冻融）。
[注] 按下列提供的PCR条件进行扩增，控制PCR循环数。注意当突变点位点超过4个时会发生突变率降低的现象。
Mutation Cycles
1~2Nucleotide 15cycles
3Nucleotides 18cycles
[B] 突变质粒选择
PCR反应结束后使用Mutazyme™酶消化甲基化质粒从而选择突变质粒DNA。
1.准备PCR反应产物。
2.加入1μl（10U/μl）Mutazyme™酶37℃温育1小时。
[注]当质粒DNA用量过多时Mutazyme™酶可能发生与样品反应不完全的现象。因此我们建议为了保证突变率请严格遵照实验步骤进行操作。如果突变率低，可以适当延长反应时间或增加Mutazyme™酶用量。
[C]转化
反应完毕后在质粒DNA上会产生缺口，当把这个质粒DNA转入E.coli中时请选择dam+型菌株，例如DH5α。
1.将10μl样品加到50μl感受态细胞里，然后放置在冰上30分钟。
2. 接下来可以参照一般的转化步骤进行。
序列分析
通常当LB平板上出白菌落则表明发生了突变。
为了证实这一结果，我们建议对白单菌落进行测序分析。
突变实例
以G G C→G A C为例
[突变反应体系]
高效除雾器10×Reaction Buffer 5μl
Sample plasmid（6.3Kb，10ng/μl，total 20ng）2μl
Sample primer（F）（10pmol/μl）1μl
Sample primer（R）（10pmol/μl）1μl
dNTP mixture（2.5mM each）2μl
dH2O 38μl
Muta-direct™ Enzyme1μl
[PCR条件]
Cycles Temperature Reaction Time 1cycle 95℃30sec
15cycle 95℃
55℃
72℃
30sec
1min
1min per plasmid Kb
[序列分析]
突变质粒测序结果
常见问题解决方案
无单菌落出现通过电泳检测PCR反应体系
如果是PCR反应的问题可以通过调节退火温度进行解决
检测感受态细胞的转化效率
突变率低Mutazyme™酶处理不当
增加Mutazyme™酶用量或延长反应时间
无线发射电路
检查模板质粒用量
质粒用量过多会引起突变率降低
错误突变检测合成引物的质量点滴板
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