8-十六烷基小檗碱与小檗碱的大鼠药代动力学和组织分布比较研究胡宇莉1, 陈超1, 邹宗尧1, 李学刚1, 2*, 叶小利3* (西南大学 1. 药学院, 2. 重庆药物过程与质量控制工程技术研究中心, 3. 生命科学学院, 重庆 400715) 摘要: 高效液相谱法测定小檗碱 (BBR) 和8-十六烷基小檗碱 (8-BBR-C16) 在大鼠血浆及组织中的浓度, 比较二者的药代动力学规律和组织分布差异, 为8-BBR-C16的机制研究及药物开发提供实验数据。大鼠灌胃80 mg·kg−1药物后, 在药动学实验结果中, 与BBR相比, 8-BBR-C16的C max、AUC0−t分别是BBR的2.8倍和12.9
倍, t l/2由3.61 h延长到11.90 h。在组织分布实验结果中, 与BBR相比, 8-BBR-C16在各种组织的分布浓度均有
显著提高, 停滞时间明显延长。其在肺中的药物浓度最高, 最高浓度达到3 731.82 ng·g−1。8-BBR-C16经衍生化
后, 在血浆中C max及生物利用度显著提高, 体内循环时间延长, 组织中的药物分布浓度显著提高, 分布比例改变,
具有较强的肺靶向性。
rs232和ttl
关键词: 8-十六烷基小檗碱; 药代动力学; 组织分布
中图分类号: R969 文献标识码:A 文章编号: 0513-4870 (2014) 11-1582-06
Comparative study of pharmacokinetics and tissue distribution of
8-cetylberberine and berberine in rats
HU Yu-li1, CHEN Chao1, ZOU Zong-yao1, LI Xue-gang1, 2*, YE Xiao-li3*
(1. College of Pharmaceutical Science, 2. Engineer Research Center of Chongqing Pharmaceutical Process and
Quality Control, 3. College of Life Science, Southwest University, Chongqing 400715, China) Abstract: The concentrations of berberine (BBR) and 8-cetylberberine (8-BBR-C16) in rat plasma and tissue were determined by RP-HPLC. Both the plasma pharmacokinetics characteristic and tissue distribution differences of BBR and 8-BBR-C16 were compared to provide experimental data for the mechanism research
and further drug development. After the oral administrations of BBR and 8-BBR-C16 at the dose of 80 mg·kg−1
for rats, the pharmacokinetics result showed that compared with BBR, the C max and AUC0−t of 8-BBR-C16 increased by 2.8 times and 12.9 times respectively, t l/2 extended from 3.61 h to 11.90 h. The tissue distribution result showed that compared with BBR, the concentration of 8-BBR-C16 in various organizations increased and the retention time extended remarkably. The maximum concentration was achieved in lung and the highest concentration in it was 3731.82 ng·g−1. After being derived, the C max in plasma and bioavailability of
8-BBR-C16 increased remarkably and the circulation time in vivo extended. The drug concentration in tissue increased remarkably, and the distribution ratio changed too, with strong targeting selection in lung.
Key words: 8-cetylberberine; pharmacokinetics; tissue distribution
小檗碱 (berberine, BBR) 是一种黄的异喹啉
收稿日期: 2014-05-04; 修回日期: 2014-06-23.
基金项目: 科技部支撑计划项目 (2011BAI13B02-1); 重庆百名高端工程技术人才资助项目; 西南大学校地合作基金 (Sz201302,
Sz201401); 教育部博士点基金 (20130182110023).
*通讯作者 Tel: 86-23-68250728, E-mail: xuegangli@swu.edu;
E-mail: yexiaoli@swu.edu 生物碱, 广泛存在于多种植物的根、茎、花和果实中。现代药理研究已经证明, BBR具有抗炎、抗菌、抗氧化、抗癌、保护心血管、保护神经系统等生理效应, 能够糖尿病、高血脂、冠状动脉疾病、脑卒中、阿尔茨海默病、焦虑症、疟疾、胃肠疾病、肾损伤、关节炎、皮肤病、多囊卵巢综合征等[1−3]。可见, BBR
的生理功能十分丰富, 潜在的结构改造和开发应用
价值非常大[4]。近年来, 许多学者以BBR为先导化合
物进行结构修饰, 以提高生物利用度和药效、增强靶
向性及减少毒副反应, 并取得了实质性的进展[5−7]。
在BBR结构中引入长链烷基, 可以显著提高其
生物活性。已有研究证实, 经长链烷基修饰过的BBR,
抗癌、抗菌活性明显增强[8, 9]。本实验室在前期实验中,
利用烷基衍生化法首次合成了8-十六烷基小檗碱[10]
(8-BBR-C16, 图1), 并证明它的降血脂活性与BBR
原形相比显著提高[11]。此外, 本课题组还得到了新化
合物8-辛基小檗碱[12], 证明了它的抗菌活性比BBR
提高100多倍[13]。
Figure 1 Structures of 8-BBR-C16 (R=-CH2-(CH2)14-CH3) and 8-dodecylberberine (R=-CH2-(CH2)10-CH3)
目前, 小檗碱长链烷基衍生物的机制探索仅限
于药效活性方面研究, 关于该类化合物的药代动力
学研究尚未见报道。基于该类化合物的高生物活性,
研究它们的药代学对于进一步的开发利用具有重要
价值。本文建立了灵敏、准确的高效液相谱分析方
法, 定量检测8-BBR-C16在生物样品中的含量, 对BBR和8-BBR-C16的药代动力学和组织分布进行对
比分析, 比较它们在大鼠体内代谢行为的差异, 并初
步探讨这种差异产生的原因。本文将为小檗碱长链烷
基衍生物的作用机制研究、药物结构优化及今后的开
发利用提供实验依据。
材料与方法
仪器 e2695-2489高效液相谱仪(美国Waters
公司), Empower 2.0工作站。
药品与试剂 BBR对照品(中国兽医药品监察
所, 批号Z0221206, 含量94.5%), 8-BBR-C16 (自制,
批号1201101, 结构式见图1), 8-十二烷基小檗碱(自
制, 批号1207071, 结构式见图1); 巴马汀(自制, 批
号1205121); Silica Catridges纯硅胶固相萃取柱 (SPE
柱, 美国Waters公司, 批号065133190, 规格200 mg/
3 mL)。
动物 SD大鼠110只, 雌雄各半, 体重250～
300 g, 由重庆医科大学实验动物中心提供, 生产许可证号: SCXK (渝) 2012-0001。实验前禁食12 h, 自由饮水。
谱分析条件 谱柱: Phenomenex Luna C8 (250 mm×4.6 mm, 5 µm); 柱温30℃; 流速: 1.0 mL·min−1; 检测波长(紫外检测器): 345 nm; 进样量: 100 µL; 流动相: 乙腈−20 mmol·L−1磷酸二氢钾溶液, 用磷酸调至pH 4.0, 其中乙腈与磷酸二氢钾溶液的混合比例分别为: 检测BBR (24∶76)、检测8-BBR-C16 (80∶20)。
药物及内标溶液的配制 BBR对照品和巴马汀(作为BBR的内标) 用水、8-BBR-C16和8-十二烷基小檗碱(作为8-BBR-C16的内标) 用二氯甲烷−乙腈(10∶90) 混合溶液, 配制得到浓度为1 mg·mL−1药物及内标储备液。二次稀释前述两种内标储备液, 得到浓度为10 µg ·mL−1的内标溶液。
样品前处理①血浆样品的前处理: 取血浆样品0.5 mL, 加入10 µg·mL−1内标溶液2 µL, 混匀, 用提取液[以二氯甲烷−乙腈 (10∶90) 混合溶液为提取液] 6 mL分两次提取, 每次振摇10 min, 5000 r·min−1离心10 min (5℃)。合并上清液在45℃氮气下吹干, 残渣用流动相300 µL复溶, 过膜, HPLC分析。②组织样品的前处理: 除胃和小肠仅各取0.1 g外, 含BBR其他组织样品取0.5 g, 含8-BBR-C16其他组织样品取0.3 g, 剪碎, 分别加入10 µg·mL−1的内标溶液2、10和6 µL。用二氯甲烷3 mL高速匀浆30 s提取, 另二氯甲烷3 mL清洗刀头。合并二氯甲烷, 12000 r·min−1离心5 min (5℃)。取下层液体, 过纯硅胶SPE 柱净化处理。
SPE净化程序 正己烷、二氯甲烷各3 mL依次活化SPE柱, 取二氯甲烷提取液全部过柱, 再用正己烷和乙酸乙酯各5 mL洗涤, 最后甲醇50 mL洗脱。取全部甲醇洗脱液40℃旋转蒸发至近干, 二氯甲烷5 mL溶解残渣, 并于40℃氮气下吹干。残渣用流动相300 µL复溶, 过膜, HPLC分析。
标准曲线的制备和定量限考察血浆或空白组织6份, 添加得到浓度分别为10、50、100、200、250和300 ng·mL−1(内标添加浓度为100 ng·mL−1) 的血浆样品和30、200、500、1 000、1 500和2 000 ng·g−1 (内标添加浓度为500 ng·g−1) 的组织样品, 对线性范围进行考察。以血浆(组织) 中药物添加浓度为横坐标(x), 药物与内标峰面积之比为纵坐标(y), 进行线性回归, 得回归方程和相关系数r。以信噪比 (S/N) 为10时的药物浓度为最低定量限 (LOQ)。
方法专属性 分别记录空白血浆、空白组织、药
物溶液和灌胃后所得血浆、组织的谱图, 并进行图谱比对。
回收率和日内、日间精密度精密量取空白大鼠血浆或空白组织, 添加制得高、中、低浓度分别为300、200和10 ng·mL−1的血浆样品和2000、1000和30 ng·g−1的组织样品。回收率考察时10天内重复测定6组, 精密度考察时每个浓度日内、日间分别平行测定6组。
稳定性 同回收率项下方法, 制得高、中、低浓度样品(n=5), 分别于室温下放置24 h后、处理完在4℃放置24 h后、反复冻融3次后、于−20℃放置两周后测定。
大鼠体内药动学和组织分布 110只大鼠随机分成两组, BBR组50只, 8-BBR-C16组60只, 均以80 mg·kg−1剂量灌胃给药。于给药后0.5、1、1.5、2、3、4、6、8、12、24、48和72 h (BBR不采集48 h 和72 h) 各摘取5只大鼠眼球取血约1.5 mL, 置肝素化EP管中, 5000 r·min−1离心10 min, 分离血浆, 于−20 ℃保存。
同时, 于1、3、8和12 h等4个时间点分别断颈处死大鼠各5只, 取心、肝、脾、肺、肾、脑、子宫、睾丸、胃和小肠, 用生理盐水漂洗, 用滤纸吸干水分后, 于−20 ℃保存。
数据分析 利用DAS3.2.1软件, 按非房室模型拟合药动学参数, 达峰浓度(C max) 和达峰时间(t max) 采用实测值。
结果
1 方法学考察
1.1 标准曲线和定量限所得结果表明, 两种药物在浓度为10～300 ng·mL−1(血浆)、30～2000 ng·g−1 (组织) 时, 线性关系良好。BBR在血浆和组织中r 分别为0.9995、0.9964～0.9999; 8-BBR-C16在血浆和组织中r分别为0.9998、0.9975～0.9998。同时, BBR和8-BBR-C16在血浆中LOQ分别为10和8 ng·mL−1, 在组织中的LOQ分别为25和20 ng·g−1。
1.2 回收率测得含BBR的高、中、低浓度血浆样品平均回收率为96.0%～104.8%, RSD为
2.5%～5.4%, 组织样品平均回收率为80.9%～88.5%, RSD为7.5%～10.2%; 含8-BBR-C16的高、中、低浓度血浆样品平均回收率为95.5%～105.5%, RSD为
3.4%～5.6%, 组织样品平均回收率为81.9%～90.4%, RSD为7.5%～10.8%。表明方法可以满足生物样品定量分析的要求。1.3 日内、日间精密度测得含BBR的高、中、低
浓度血浆样品日内RSD为3.4%～5.5%, 日间RSD为
2.5%～5.4%, 组织样品日内RSD为5.9%～9.1%, 日
间RSD为7.5%～10.2%; 含8-BBR-C16的高、中、
低浓度血浆样品日内RSD为3.4%～6.4%, 日间RSD
为3.4%～5.6%, 组织样品日内RSD为8.9%～11.4%,
日间RSD为7.5%～10.8%。
1.4 方法专属性从图2可以看出, BBR和
8-BBR-C16 均能和血浆中的内源性干扰成分达到很
好的基线分离, 药物出峰位置处无干扰, 方法的专一
性良好。SPE前处理方法去除了脂溶性干扰成分, 较
好地纯化了样品。
Figure 2Representative chromatograms of A1: Blank plasma;
A2: Blank liver; B1: Standard BBR, B2: Standard 8-BBR-C16, C1: Plasma obtained 1 h after oral administration of BBR, C2: Plasma obtained 1 h after oral administration of 8-BBR-C16, D1: Liver obtained 1 h after oral administration of BBR, and D2: Liver obtained 1 h after oral administration of 8-BBR-C16. Peaks 1: Palmatine; 2: BBR; 3: 8-Dodecylberberine; 4: 8-BBR-C16
1.5 稳定性 室温下放置24 h后、处理完在4℃放
置24 h后、反复冻融3次后、于−20℃放置两周后, 这4种条件下BBR的高、中、低浓度血浆(组织) 样
品RSD为1.1%～3.3% (7.4%～10.4%)、1.6%～2.5% (8.0%～11.9%)、2.4%～4.1% (5.8%～11.5%)
和1.7%～
3.0% (8.3%～11.4%), 8-BBR-C16的高、中、低浓度血
浆(组织) 样品RSD为1.0%～5.6% (10.8%～11.9%)、1.1%～4.8% (7.5%～9.8%)、2.1%～5.0% (8.6%～11.6%) 和1.5%～4.7% (8.8%～10.8%)。结果表明药
物在所考察的条件下稳定, 符合生物样品测定要求。
2 药动学和组织分布
2.1 药动学血药浓度−时间曲线见图3, 主要药代
动力学参数见表1。结果表明, 结构改造后所得的8- BBR-C16与BBR原形相比, 吸收规律发生显著变化,
具有以下特点: ①C max明显变大, 由原形的45.92
µg·L−1升高到129.41 µg·L−1。②生物利用度显著提
高。BBR和8-BBR-C16的AUC0−t值分别为201.76
µg·h·L−1、2609.21 µg·h·L−1。与8-BBR-C16相比, BBR
的相对生物利用度仅为7.7%。③药物的半衰期变
长, 消除变慢, 在体内的滞留和循环时间更长。④8- BBR-C16的血药浓度−时间曲线存在明显的双峰。
方波信号发生器
Figure 3 Plasma concentration-time curves of BBR and
8-BBR-C16. n=5, x±s
Table 1 Main pharmacokinetic parameters of BBR and 8-BBR-
C16. n=5, x±s. **P<0.01 vs BBR
Parameter BBR 8-BBR-C16 t max/h 1.50 ± 0.52 1.50 ± 0.43
C max /µg·L−1 45.92
±
2.44
129.41 ± 25.58** t1/2 /h 3.61 ± 0.49 11.90 ± 1.77**
AUC0−t /µg·h·L−1201.76 ± 16.72 2 609.21 ± 136.47**
MRT0−t/h 3.38 ± 0.08 16.56 ± 0.85**
CL /L·h·kg−1299.03 ± 39.83 28.68 ± 1.43**
2.2 组织分布结果表明, 8-BBR-C16在大鼠体内
的组织浓度大幅提高, 分布比例发生变化, 分布更为
广泛, 停滞时间也变长(图4)。
讨论
以往的研究证明, BBR的肠道吸收效率极低, 绝
对生物利用度低至0.68%[14]。导致BBR生物利用度
比较低的原因有两个: 一是药物的物理化学性质。BBR是季铵碱, 脂水分配系数为−1.5[15]。药物结构中
含有季铵基团者, 亲水性强, 穿透细胞膜的能力低,
限制了药物的跨膜转运和肠道吸收, 其生物利用度
往往较低[15]。导致BBR生物利用度较低的另外一个
Figure 4 Tissue concentrations of BBR and 8-BBR-C16 at 1, 3, 8, and 12 h. n=5, x±s. A1: BBR; A2: 8-BBR-C16
原因是BBR为P-gp糖蛋白的底物[16]。P-pg糖蛋白位于细胞膜上, 具有药物外排泵作用, 它的转运作用导致被吸收的BBR被分泌返回肠道。
药代动力学实验结果显示, 二者之间多个药代动力学参数具有显著性差异。8-BBR-C16的C max、AUC0−t分别是BBR的2.8倍和12.9倍, 提示8-BBR- C16更利于吸收; t l/2由3.61 h延长到11.90 h, 提示8- BBR-C16消除明显变慢。已有报道, 中等大小亲脂性取代基的存在是提高药物活性的关键[17], 而且烷基具有疏水性, 在化合物的碳链中增加一个-CH2-, 则脂水分配系数可以增加2～4倍[18]。因此在BBR中引入烷基增加了先导药物的脂溶性, 使8-BBR-C16在大鼠体内的药动学规律发生显著改变。另外, 8-BBR- C16血药浓度−时间曲线存在明显的双峰。导致双峰现象的原因可能有分布重吸收和肠肝循环[19]。如果组织中的药物浓度远远高于血浆中的, 药物就可能从组织向血浆转运(分布重吸收), 导致血浆中第2个峰的出现[20]。从8-BBR-C16的组织分布结果来看, 大多数组织中药物浓度都比血浆中的高很多。所以, 分布重吸收是导致8-BBR-C16药−时曲线出现双峰的重要原因。肠肝循环指经胆汁排入肠道的药物, 在肠道中重新被吸收, 经门静脉返回肝脏的现象。8-BBR-
C16是否存在肠肝循环则需要更进一步的实验来确证。小檗碱口服给药具有吸收困难、代谢迅速、血药
浓度低的特性[21], 上述结果表明, 8-BBR-C16脂溶性
提高后, 在大鼠体内的吸收规律发生明显变化, 对提
高生物利用度和药物疗效具有积极的意义。
从BBR和8-BBR-C16的组织分布结果中可以
看出, 胃肠始终是分布的优势组织, 表明它们在胃肠
的吸收较慢且不完全。这与文献报道相符, 同时也解
释了在临床应用中BBR及其制剂是很好的胃肠
疾病药物的原因。本实验中, 除去胃肠, BBR在肝脏
分布浓度最高, 与文献[22, 23]报道吻合; 其次组织是脾。十六碳烷基链的引入, 对药物的组织分布产生了
显著影响, 大多数组织中药物浓度大幅提高, 并改变
了药物在体内各组织的分布比例。特别是肺中的浓
度最高(不包括小肠和胃时), 超过了除胃肠外所有
闪蒸塔
组织中药物浓度的总和, 显示出较强的肺靶向性。而且, 在8和12 h, 检测到肺中的药物浓度超过了小肠
和胃, 说明8-BBR-C16在肺中的消除较慢, 使得滞留
时间延长。这与肺组织具有较好的亲脂性有关。另外,
8-BBR-C16在组织中的分布也更为广泛。例如, 在大
脑和睾丸中的分布发生了从无到有的转变。影响药物
向各种组织分布的主要因素有组织中血流量、组织的
毛细血管内膜屏障、药物与蛋白的结合及药物与组织
的亲合力[18], 也就是药物的分布取决于组织的生物
因素及药物的结构因素。组织的毛细血管内膜为多孔
性的脂质膜, 药物具有较高的脂溶性可以使其容易
地通过内膜到达组织内部, 使得药物从血液向组织
的转运速率提高且组织亲和力增强。本课题组通过十
六碳烷基链的引入, 达到了使结构优化后的BBR更
易通过体内脂质膜的目的。
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