目的：观察辅酶Q10（CoQ10）对大鼠实验性牙周炎的影响作用。方法：选取雄性SD大鼠168只，随机分为正常组（N）、模型组（P）、替硝唑组（T）、维生素C组（VC）、辅酶 Q10低、中、高剂量组（LQ、MQ、HQ）。灌胃給药第2、4、6周，随机抽取8只，采血检测血浆中IL-1β、TNF-α、PGE2、SOD、GSH-Px、MDA水平；测量大鼠牙槽骨附着丧失，并行HE染、TRAP染。结果：CoQ10可降低血浆中IL-1β、TNF-α、PGE2水平；增加SOD、GSH-Px活力，减少MDA含量。结论：CoQ10可抑制和缓解大鼠实验性牙周炎。
标签： 辅酶Q10；牙周炎；氧化应激
Abstract：Objective To investigate the effect of coenzyme Q10（CoQ10）on experimental periodontitis in rats. Methods 168 healthy SD rats were randomly divided into normal group （n）， model group （P）， tinidazole group （T） and vitamin C group （VC）， coenzyme Q10 low， medium， high dose group （LQ， MQ，HQ）. Intragastric administration for week 2，4，6， 8 rats were randomly selected to detect IL-1β、TNF-α、PGE2、SOD、GSH-Px、MDA of their peripheral blood； The ABL value was detected， a
nd the HE staining and TRAP staining were performed. Results CoQ10 could significantly decrease the levels of IL-1β， TNF-α， PGE2 ；the activity of GSH-Px and SOD increase more， and MDA decrease . Conclusion CoQ10 can inhibit the experimental periodontitis in rats.
Keywords：Coenzyme Q10；Periodontitis； Oxidative Stress
牙周炎（Periodontitis）是一种牙周组织的慢性炎症性疾病，牙周致病菌作为使动因子激发了宿主过度的炎症反应，通过“呼吸爆发”生成大量自由基，从而破坏和损伤牙周组织细胞[1]。烟草中含有很多种具有较高药用价值和营养价值的物质，如辅酶Q、茄尼醇、多酚类化合物等。辅酶Q10（Coenzyme Q10，CoQ10）是一种内源性脂溶性的抗氧化剂，能清除机体的自由基，在心血管疾病、糖尿病、神经系统等疾病领域都具有一定效果[2]。因此，本实验以烟叶废料中提取的脂溶性CoQ10作为受试样品，通过建立大鼠实验性牙周炎模型，初步探讨CoQ10对实验性牙周炎的影响。 1 材料与方法
1.1 试剂 CoQ10（本课题组委托云南中医学院实验中心由云产废弃烟末中提取，纯度>99%）；替硝唑（纯度98%，美仑生物）；维生素C（纯度99.99%，上海阿拉丁）；调和油（丰益贸易私人有限公司）；水合氯醛（纯度99%，Solarbio公司）；多聚甲醛（纯度95%，天津市光复精细化工研究所）；TRAP染试剂盒（美国sigma公司）；大鼠TNF-α ELISA、大鼠IL-1β ELISA、大鼠PGE2 ELISA等试剂盒购自深圳欣博盛；SOD试剂盒、MDA试剂盒、GSH-Px试剂盒购自南京建成。
1.2 仪器 AL204型高精密电子分析天平（德国Mettler Toledo，精度0.0001g）；5415R型低温高速离心机（德国eppendorf）；BM-IX型组织包埋机（中国孝感生物）；HH·S11·Cr2型电子恒温水浴锅（汕头医用设备有限公司）。
1.3 方法
1.3.1 实验动物及分组 清洁级健康雄性SD大鼠168只，体重200g左右（购自四川省简阳市简城比尔动物养殖场，许可证号：SCXK（川）2013-24，合格证号：003425）。将实验动物分为7组：正常组（N组）、模型组（P组）、替硝唑组（T组）、维生素C组（VC组）、CoQ10低剂量组（LQ组）、CoQ10中剂量组（MQ组）、CoQ10高剂量组（HQ组）频闪灯
，每组24只。正常组不做处理，常规饲料喂养，正常摄水。
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1.3.2 牙周炎模型的建立 实验动物适应性喂养1周后，除N组大鼠外，其余大鼠通过丝线结扎+粘性高糖饮食复制大鼠实验性牙周炎模型[3]。7%水合氯醛0.3mL/100g腹腔注射麻醉，大鼠仰卧位固定，充分暴露视野。用4/0#医用丝线，在大鼠双侧上颌第二磨牙环牙颈部结扎，腭侧打结，并使丝线尽量位于龈沟内。同法结扎对侧上颌第二磨牙。结扎后每3～4天观察1次，检查时发现结扎丝脱落及时重新结扎。并从实验当天，造模组给于黏性高糖饮食。造模4周后，进行牙龈指数（GI）检测，用钝头探针，沿根面平行探入大鼠上颌第二磨牙腭侧位点的袋底，探诊力量在20～25g。探诊后10～30s记录出血情况：0表示牙龈健康；1表示牙龈有轻度的炎症：牙龈轻度水肿，颜轻度改，探诊不出血；2表示牙龈有中等程度炎症：牙龈水肿光亮且红，探诊出血；3 表示牙龈有严重炎症：牙龈红肿明显或伴有溃疡，有自动出血的倾向。1.3.3 大鼠灌胃 造模成功后次日， N组为正常大鼠，灌胃CoQ10溶剂调和油； P组为牙周炎大鼠，灌胃CoQ10溶剂调和油；T组为牙周炎大鼠，首日灌胃替硝唑200mg/kg，次日灌胃替硝唑100mg/kg[4]； VC组为牙周炎大鼠，灌胃維生素C剂量为100mg/kg[5]；LQ组为牙周炎大鼠，灌胃辅酶Q剂量为15mg/kg； MQ组为牙周炎大鼠，灌胃辅酶Q剂量为30mg/kg； HQ组为牙周炎大鼠，灌胃辅酶Q剂量为60mg/kg[6]。
按上述剂量，灌胃量均为1.25mL/kg，每天1次，早上9点开始灌胃给药。
1.4 指标的检测
1.4.1 标本采集 每组分别于灌胃第2、4、6周末随机处死8只大鼠，取其血浆，-80℃保存，用于相关炎症因子及氧化应激指标的检测；取其左上颌去净软组织，置于75%酒精中，用于牙槽骨丧失值检测；右侧上颌骨浸于4%多甲固定液中固定，用于后续组织学检测。
1.4.2 ABL值检测 取左侧去净软组织的大鼠上颌骨，用电子数显卡尺测量其上颌第二磨牙釉牙骨质界至牙槽嵴顶的距离。每颗牙测量6个位点：近颊、中颊、远颊、近腭、中腭、远腭。测量均值为该颗牙ABL值，以“x±s”表示。
1.4.3 苏木精-伊红（Hematoylin-Eosin，HE）染 常规脱钙包埋，近远中向连续5微米厚度行组织切片，脱蜡至水，并进行水洗10s，加入苏木素液15min，流水冲洗1min，浸泡于1%盐酸酒精中30s后，再进行30min流水冲洗，浸泡于伊红染液中30s，流水水洗10s，在梯度酒精中进行脱水，过二甲苯中透明处理，滴加中性树胶进行封片。于光学显微镜镜下观察大鼠第一、二磨牙，第二、三磨牙之间牙周组织的病理改变。
1.4.4 抗酒石酸酸性磷酸酶（Tartrate-Resistant Acid Phosphatase，TRAP）染 根据试剂盒说明进行TRAP染，破骨细胞的鉴定标准：细胞核为多核、细胞浆呈现嗜酸性、并有多条伪足、细胞体体积大、形状不规则，直接接触牙槽骨表面或者在骨吸收陷窝里，进行TRAP染以后，细胞浆则呈红，核呈蓝。高倍显微镜（×400）下观察，以牙槽嵴顶作为起始点，随机选取第二磨牙近远中侧牙槽嵴边缘的4个不重叠视野，分别计算每一个视野内的破骨细胞数，并计算其均值，作为该片的破骨细胞数，每组随机抽取4张切片观察。 彩铅芯
1.4.5 炎症因子检测 按ELISA试剂盒说明检测各组各时间点大鼠血浆中炎症因子白细胞介素1β（Interleukin-1Beta，IL-1β）、肿瘤坏死因子α（Tumor Necrosis Factor-Alpha，TNF-α）、前列腺素E2（Prostaglandin E2，PGE2）的含量。
印花交联剂
1.4.6 抗氧化指标检测 按抗氧化指标检测说明书操作，检测大鼠血浆中谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathione peroxidase，GSH-Px）、超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）的活力和丙二醛（Malondialdehyde，MDA）含量。
1.5 统计分析 所有数据均由SPSS17.0数据统计软件包处理，各组数据间采用LSD-t检验、
单因素方差分析（One-way ANOVA）来进行比较，P＜0.05表示差异具有统计学意义。
2 结果与讨论
2.1 牙周炎模型的确立 建模术后4周时，牙周炎模型大鼠牙龈呈暗红，龈缘圆钝，探诊点状出血，少数伴有牙龈溃疡，其GI值为（2.5±0.53），正常大鼠牙龈粉红，质地坚韧，探诊无出血，其GI值为0，两者差异具有统计学意义（P＜0.05）。造模术后4周，随机抽取实验动物，通过HE染观察发现结合上皮与牙体分离，上皮及固有层大量炎性细胞浸润，上皮钉突向结缔组织伸长，胶原纤维的排列紊乱，大鼠上颌第二磨牙近远中牙槽嵴顶破坏吸收严重，以此来确定大鼠牙周炎模型建立成功。如图1、2所示。
2.2 ABL值检测结果比较 通过对大鼠上颌骨ABL值检测，可较为直观观察灌胃CoQ10后牙周炎大鼠牙槽骨的恢复情况。各组各个时间点之间相比较，N组的ABL值均低于P组、T组、VC组和CoQ10各剂量组，差异具有统计学意义（P＜0.05）；2、4、6周，P组与N组、VC组和CoQ10各剂量组相比，差异无统计学意义（P>0.05）。且在三个时间点来看，CoQ10各剂量组和T组、VC组相比，差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。徐艳丽等[7]用水溶性CoQ10（9 mg/kg）给患有Ⅱ型糖尿病牙周炎的大鼠进行连续灌胃11周，发现
大鼠牙槽骨垂直吸收高度并没有改变，但却可以观察到RANKL/OPG比值增大，表明CoQ10是可以抑制破骨细胞分化，影响骨吸收及骨形成。虽然徐艳丽等人的实验结果与本实验结果具有相似性，但本实验研究的是大鼠的牙周炎模型，且最长的观测时间是6周，与伴糖尿病的牙周炎模型有一定区别。目前关于牙周炎时CoQ10对牙槽骨吸收的影响研究甚少，因此有待进一步的研究。
2. 3 HE染结果 N组第二磨牙近远中面牙龈乳头正常，牙龈上皮完整，结合上皮附着位CEJ处，无附着丧失，牙周膜纤维排列整齐，牙槽嵴顶高度正常。灌胃2周末，P组与T组、VC组、CoQ10各剂量组大鼠相似，出现附着丧失，牙周膜纤维排列紊乱，牙槽嵴顶吸收，固有层炎细胞浸润，如图3所示。灌胃4周末，P组大鼠磨牙之间的龈乳头丧失，见明显附着丧失，牙周膜纤维的排列呈现紊乱，牙槽骨明显吸收，大量纤维断裂，其间有炎症细胞的浸润；T组、VC组和CoQ10各剂量组相似，附着丧失，炎症细胞浸润，但较模型组相比，牙周膜纤维紊乱程度改善，牙槽骨吸收程度也不及模型组明显。如图4所示。灌胃6周末，P组大鼠磨牙间牙龈乳头丧失，牙龈上皮表面糜烂，牙周膜纤维排列紊乱，纤维断裂，炎症细胞浸润，牙骨质呈虫蚀样破坏吸收；T组、VC组及CoQ10各剂量组炎性细胞浸润牙周膜纤维排列较整齐，牙槽峭顶有新骨形成。如图5所示。表明灌胃CoQ10可改善牙
周炎大鼠的牙周组织，促进牙周膜纤维的修复，减少炎性细胞浸润程度，但对牙周附着丧失的改善程度不明显。2.4 TRAP染结果 于×400镜下观察大鼠牙槽嵴顶区破骨细胞变化情况并计数。如图6所示。各组各个时间点之间相比较，P组牙槽嵴顶区的破骨细胞数明显多于N组（P＜0.05）；各时间点CoQ10各剂量、T组、VC组的破骨细胞数与P组之间差异无统计学意义（P>0.05）。且CoQ10各剂量组与T组、VC组之间差异无统计学意义（P>0.05）。见表2。牙槽骨的吸收破坏是牙周炎主要的病理变化之一。对于牙周炎的，除了基础和手术等方法外，药物的使用也对控制炎症、阻断牙槽骨吸收和促进骨再生起到良好的辅助作用。有学者提出[8]，抗氧化剂能清除破骨细胞中内源性自由基的生成，同时抑制破骨细胞形成过程中由自由基诱导的信号通路来抑制核因子κB受体活化因子配体（RANKL）诱导的破骨细胞产生。由此认为抗氧化剂对于急性进行性骨吸收疾病具有潜在的作用。Moon等[9]体外研究显示，CoQ10能显著降低骨髓来源的单核细胞和RAW 264.7细胞中RANKL诱导的TRAP阳性多核细胞的形成；并且CoQ10能呈剂量依赖性地抑制破骨细胞中TRAP和破骨细胞相关免疫球蛋白样受体的表达。但本实验所得到的破骨细胞实验结果是基于体内的动物实验，体内内环境复杂，可能是造成两者结果差异的主要原因之一。此外，成骨和破骨都是骨质代谢的两个重要方面。CoQ10对牙周炎大鼠破
骨细胞无明显抑制作用，不表示对成骨细胞也无作用。因而尚不能说明CoQ10对减少牙周炎大鼠牙槽骨区的破骨细胞无明显作用。
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