第22卷第1 1期202U年11月
辽宁中医药大学学报
JOURNAL OF LIAONING UNIVERSITY OF TCM
Vol.22 No. 11
Nov.,2020
DOI： 10.13194/j.issn.l673-842x.2020.11.021
温和灸“上巨虚”“天枢”穴对肠易激综合征
何雨霞1，储浩然2，仝理1，李难2，孙培养2，吴立斌1
(1.安徽中医药大学，安徽合肥230038;2.安徽中医药大学第二附属医院，安徽合肥230061 )
摘要：目的探讨温和灸对结肠、下丘脑Orexin及O x lR表达的影响以及大鼠内脏高敏感性的可能作用 机制 方法选取SD雄性大鼠，随机分为正常组、模型组和温和灸组，每组均为10只艾灸组温和灸“上巨虚”“天枢”穴，每穴灸30 mm，每天1次，连续施灸7 d建立IBS-D大鼠模型采用慢性束缚联合番泻叶灌胃法；测定肠内脏敏感性 采用非伤害性结直肠球囊扩张反射容量阈值方法；结肠和下丘脑组织Orexin及O x lR的表达水平检测采用PCR技 术，并分析其表达与IBS-D大鼠内脏敏感性的相关性结果模型组相比正常组大鼠稀便率显著升高、腹部回缩反 射的最小容量阈值显著下降（P<0.01 )，经温和灸干预后，温和灸组大鼠稀便率显著下降、腹部回缩反射的最小容量 痛阈值较模型组显著升高（P<0.m模型组大鼠结肠、下丘脑Orexin及O x lR的表达明显低于正常组（P<0.01 )；经温和灸干预后，温和灸组大鼠结肠和下丘脑Orexin及O x lR的表达明显高于模型组（P<U.(I5 )：结论温和灸“上巨 虚”“天枢”穴IBS-D的作用机理可能是通过脑肠互动调控信息影响结肠和下丘脑Orexin及O x lR的表达，而改善肠内脏敏感性
关键词：温和灸；肠易激综合征；内脏敏感性
中图分类号：R245 文献标志码：A文章编号：1673-842X(2020> 11-0088-04
Effect o f M ild M oxibustion on “Shangjuxu” and “T ianshu” points on the Expression o f O rexin—A and Its Receptor in Rats with Irritable Bowel Syndrom e
HE Yuxia1,CHU Haoran2,TONG Li1,LI Nan2,SUN Peiyang2,WU Lihin1
(1.Anhui University of Chinese Medicine,Hefei 230038, Anliui,C hina; 2.The Second Affiliated
H〇sj»ilal of Anhui Dniversitv of Chinese Medicine,Hefei 230061 ,Anhui,China )
A bstract: Objective To explore the effect of Mild moxibustion on the expression of Orexin and OxlR in colon and hypothalamus and the possible mec hanism of visceral hypersensitivity in rats.M ethods SD male rats were randomly divifled into three groups：normal group,model group and mild moxibustion group, with10 rats ill ear.h group.In the mild inoxihustion group,the“Shangjuxu”anrl“Tianshii”points were gently moxibustion for 30 m inutes,once a flay,for 7 consecutive days.To establish IBS—D rat m odel, chronic restraint comhinerl with senna leaf gavage was u sed;the gut visceral sensitivity was measured by noninvasive colorectal balloon dilation reflex volume pain threshold m ethod;the expression levels of Orexin and OxlR in colon and hypothalamus were detectecl by P C R,and the correlation between the expression and visceral sensitivity of IBS—I)rats was analyzed.Results Compared with the normal group,the model group signific antly increased the defecation rate and the minimum volume pain threshold of abdominal retraction reflex(P<0.01 ). After moxibustion,the model group significantly clecreased the defecation rate and the minimum volume pain threshold of abdominal retraction reflex (P<0.()1 ).The expression of Orexin and Oxl H in the colon and hypothalainus of the model group was significantly lower than that
of the normal group (P<0.01 );after Mild moxibustion,the expression of Orexin and O xlR in the colon and hypothalamus of the Mild moxibustion group was significantly higher than that of the model group (P<0.05 ).Conclusion The mechanism of mil<l moxibustion on“Shangjuxu”and iTianshir，points in the treatment of IBS—D may he to improve gut visceral sensitivity l>y iniluen('ing the expression of Orexin and OxlR in colon and hypothalamus through brain gut interartion regulation information.
K eyw ords：mild moxibustion;irrital)le bowel syndrome;visceral sensitivity
肠易激综合征（irritable howel syndrome，IBS )是一种常见的肠系病，它以胃肠道系统功能障碍、大便性状变化、腹部不适或腹痛为特征。有研究数据显示，在我国，丨B S发病率为0.82%〜1丨.5%，西方国家为9.0%~22.0%，不同国家及地区发病情况不同丨丨-2丨。现代研究还不能明确IB S-D的发生机制，但内脏敏感性增高被认可是其核心机制之一，可导致肠道系统功能出现障碍111 ，脑肠互动在丨BS生理病理过程中有着重要作用，与脏器感觉敏感密切相关，脑肠轴能够调节脏器感觉变化。在脑肠互动关系中，Orexin (尤其是Orexin-A )及Oxl R参与痛觉传导与抑制以及胃肠动力的调节过程，参与内脏感觉调节141艾 灸不仅可以消除IBS患者临床症状引起的不适，又 可以改善应激引起的内脏改变，对IBS-1)患者的应
基金项目：国家自然科学基金面上项H( 81774399 )
作者简介：何雨霞（1994- K女，安徽池州人，硕十研究生，研究方向：针灸推拿学.
通讯作者：储浩然（丨％2-)，男，安徽贵池人，主任医师，研究方向：针灸的临床应用及机理研究
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激性内脏敏感痛，起较好的镇痛效果.有利于UiS的 |5|3温和灸是一种艾灸方式，本研究以温和灸“上戸.虚”“天枢”穴对IBS-D大鼠的结肠、下丘脑的Orexin及Ox1H的表达和肠内脏敏感性作为切人点，探讨温和灸对结肠、下丘脑Orexin及Oxl K表达的影响及大鼠内脏高敏感性的可能作用机制
1材料与方法
1.1动物分组及处理方法
动物：S D雄性大鼠，体质量180~220 g；实验大鼠购自安徽省医学科学研究所[生产许可证SKX K (皖）2007-001〗，动物安排在安徽中医药大学动物饲养中心词养，11级饲养条件，置于受控的光照/黑暗条件下（光照时间7: 00_19: 00 )，空间温度维持在22~25 t，环境湿度控制在45%~60%，正常词养1周 后被用于实验。将S D雄性大鼠采用随机对照表方法分为模型组、温和灸组和正常组，每组大鼠各丨0 只。所有的实验都是在清醒的大鼠身上进行的，若实验大鼠出现状态异常则不纳人实验分析。
1.2 实验药物
制备番泻叶溶液：番泻叶来自安徽中医药大学针灸医院草药房，挑拣番泻叶，将番泻叶放入100 T；沸水中保温浸泡30 m in，叫双层纱布将滤液过滤浓缩为0.6 g/m L的生药，装入瓶中放-4T：冰箱保存，以备使用。
1.3 模型建立[6]
采用慢性朿缚联合番泻叶灌胃法建立实验大
鼠模型。模型、温和灸组大鼠给予番泻叶溶液灌胃(0.45 g/m L, 1mL/100 g )，灌胃后，用剪短的粗麻绳绑住大鼠双后肢，使双后肢不能自由活动，放人饲养箱中束缚1h后解绑，连续灌胃+束缚14 <1.正 常组大鼠灌胃同番泻叶溶液等体积的蒸馏水14 <1，不束缚。
1.4 穴位及艾灸
穴位：双侧t.巨虚、天枢。上巨虚|7|：腓骨小头向下10 m m处.位于大鼠后肢外侧；天枢|7|：在胸剑联合下40 mm，前正中线左右旁开5 m m，位于大鼠腹部。
温和灸组采用温和灸施灸方法，自制艾灸支架，将特制细艾条固定在支架上，艾灸穴位孔径为0.5 c m，点燃后悬挂在穴位上方约2 f m处，每处施灸30m i n,l d 1次，不间断施灸7d。
1.5 标本采集
结肠组织：两次A W K评分进行结束后，实验大鼠12 h内不进食，经腹腔注射10%的水合M醛(3 mL/k g)，待大鼠夹尾无反应时，快速打开腹腔到肠组织，在肛门到近端的结肠中取1c m结肠，剪 开结肠，在装有生理盐水的瓶中清洗干净后，储存在液氮中，作为结肠标本
下丘脑组织：取完结肠组织后用75%酒精在颈部上下5 c m内消毒，用手术剪从颈部快速剪开，
止血钳、镊子等器械撬开大鼠颅骨，剥离出完整的脑组织，用0.9%N S冲洗脑组织，将脑组织放在干净的
冰袋上，分离下丘脑，留下下丘脑组织，作为标本，将标本分别标记后，装在配置浓度为4%的多聚屮醛瓶中将结肠、下丘脑组织在48 h后脱水常规石蜡包埋,4 保存以供P C R技术检测使用。
棉花糖机械1.6 主要器材与试剂
主要器材：普通P(：丨《仪（杭州晶格科学仪器有P艮公司）、突光定量PC K仪和PIKO Plate Illuminator (Thermo Scientific.)、微量移液器（德国Eppendorf)、高速冷冻离心机（安徽嘉文仪器装备有限公司）、微孔板离心机（杭州奥盛仪器有限公司）、低速离心机(海门市其林贝尔仪器制造有限公司）、研钵、艾条(江苏康美制药有限公司）、镊子、手术剪、止血钳等器械。
主要试剂：Trizol试剂（Life technogies )、氣仿和无水乙醇和异丙醇（I.•.海苏懿化学试剂有限公fO)N
DEPC—H2〇 (Oeneray Biotech ),Novostart SYBR qPCR SuperMix Plus(novoprotein),RevertAidTM first Strand cDNA Synthesis Kil(Thermo Scienlific )，引物合成（Sangon
1.7 指标观察与检测
每日束缚前，观察大鼠日常基本情况，如精神状态如何、毛变化与否、活动状况等。
1.7.1 稀便率的计算
在造模后和干预结束后第1天，将大鼠放在笼子底部为不锈钢网的笼中词养，下面放置大小合适的托盘，托盘上垫一张滤纸，6 h后，察看滤纸上留下印迹的稀便情况，根据公式得出各组大鼠的稀便率
计算公式为大鼠在单位时间内所排稀便数与排便总数之间的比值，即稀便率（％ )=排稀便数/排便总数x 100%。若6 h内大鼠排便总数为0，则计算公式无效，为使稀便率的计算有效，将排便总数为0时 调整为1。区别干稀便的标准是，滤纸上留下污渍则为稀便^
1.7.2 A W R评分
内脏敏感性评估：意识状态下大鼠结肠胀痛反应的内脏疼痛通过腹肌收缩进行评估。在两次稀便率试验结束后，采川结直肠球囊扩张反射（C R1))测 定肠内脏敏感性在测试开始前12 h，实验大鼠不进食，
自由饮水，先用少t t b氟烷在密闭玻璃罐中轻度麻醉大鼠，大号透明实验鼠固定器固定老鼠，然后经肛门将润滑后的8F导尿管插人肠内，球'旗末 端距肛门约为I c m，将导管用医用胶带绑在鼠尾根部，固定在合适位置，防止其脱出。大鼠清醒后，适应在固定器内进行小范闱前后活动，然后用注射器将26~28t生理盐水注人球囊内，球囊扩张肠道，诱导结肠收缩膨胀，直到可见腹壁收缩反射被观察到，记下使大鼠腹壁收缩反射（AWR )的最小容量阈值痛阈值被定义为引起可观察到的腹壁收缩反射(AWR )的结肠扩张的强度，即突然的和持续的腹肌收缩。大鼠放置在间定器内，同时仍处于镇静状态，恢复20 m in后再次进行测试，记录3次测试值得出
平均值，记为该大鼠的最小容量阈值。
1.7.3 结肠和下丘脑的O rex in及O x l R的检测步驟
KT-P C R技术被用于检测下丘脑和结肠的Orexin及()x川的表达水乎.①组织总R N A的提取：用TRIzol试剂从采集的标本中提取，室温干燥沉淀，加人20〜50 (x l,D EPC水，-80T：保存备用。②KT 反应：在E P管中进行KT反应，逆转录反应完成，取出反应液，则是<‘I)NA, -801保存。③PCF{反应：取出rD N A作为模板，在下列条件下进行P C K反应：
_
;
一液晶显示器反光
正
*m
樓
s m
温和灸
m
B
_
• •正
*a
模
sm
a 和灸
m
正
*m
樓
a« a 和灸m
A
正常
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c
1
aa
_■
_I I
1
1111
m 干
fT 前 千预后
正常组 模型ffl 温和灸m
正常《 模型m 温和灸m
注：与干预前正常组比较，A A p <o .oi ；与干预后温和 灸组比较，■_P <0.01
m
i 各组大鼠稀便率情况比较u =m ,s ±s )
2.2 A W R 评分结果
大鼠腹壁收缩反射的敁小容a 阈值在模型组
和未干预的温和灸组均低于正常组（P <〇.〇l )；温和 灸干预之后，大鼠腹壁收缩反射的最小容M 痛阈值 相较于模型组均偏高（p <0.01 )，见丨冬 12
沈：与十预前正常组比较，△ A /><().〇丨；4干预后温和
灸组比较.■■丨)<〇.〇丨
图2 各组大鼠引起腹部M 缩的最小容量
痛阈值情况比较（n =l 〇,；v ±.s ' )
2.3 PCR 检测结肠和下丘脑的O rexin 及其受体OxlR 的表达
模型组大鼠的结肠Ox 丨丨《和O rexin 、下丘脑组 织Ox I K 和Orexin 的表达相较正常组均降低显著 (P <0.01 )；温和灸组与模型组比，大鼠的下丘脑 (>xl 丨{、结肠组织0x 1丨i 、结肠Orexin 的表达均明©. 增高（P <O.OI )；下丘脑O rexin 表达相较模型组偏高 (f ><0.05 )，见图 3。3 讨论
在中医学上，IB S -D 属于“泄泻”“腹痛”，其发 作与情志、饮食等密切相关，m s -D 之泄泻多因感 受外邪，情志失调，饮食不节，伤及脾胃，睥虚生湿，
90
注：与正常组比较，△△"<〇.()丨；与模型组比较，
■ ■P <0.01 ,B P <0.05
图3 结肠和下丘脑的及其受体
OxlR 的表达（n = 10, S ± .、■)
湿邪闲脾，肠胃功能失调IW 发为泄泻；1BS - D 之腹痛 多W 寒邪日久，郁积化热.气机郁滞，经脉不通，脉络 搏附Iflf 发为腹痛。IBS 在中医中M 大肠病，大肠为 腑，属六腑病候上巨虚、天枢二穴都属于足阳明胃 经，二穴相配为大肠经合募配穴。临床上有“合治 内府”和“腑病取募”之说，又有“合募二者上下远 近配穴，一升一降，纵横交织消除腑病”之说，二者 相配相辅相成，体现；丨标本根结理念《医学人门》 中有"凡药之不及，针之不到，必须灸之”一说，表明 艾灸疗效独特，在长期艾灸临床实践中，总结出温和 灸肠腑病的疗效W .苦，温和灸大肠经合募二穴 可起到畅通肠腑、消积化滞、镇痛止泻、行气通便等 作用。
内脏感觉被认为是由屮枢神经系统控制的关 键忾肠功能之…，是内脏感受感知内环境的刺激而 产生的感觉现代研究认为内脏的超敏反应在患者 中普遍存在，其产生机制涉及多种W 素，如脑肠轴'火 调、肠黏膜免疫活化增加、肠通透性增加、内脏高敏 感等其中内脏高敏感形成与肠道感觉神经系统 (ENS )的敏感性增力口、中枢神经系统（CNS )调节紊 乩、脊髓背根神经元的过度兴奋冇关，既可单独增加 敏感性，亦可联合增加*121有研究表明〜^温和灸 对肠易激综合征患者的肠敏感性和痛阈有明显的下 调作川。结合本实验结果，模型组大鼠较正常组稀 便率叫显升高、腹部H 缩的最小容量痛阈值明显卩 降；经温和灸干预后，温和灸组稀便率降低、腹部H 缩的最小容a 痛阈值明敁高于校型组，表明温和灸 n J ■以缓解大鼠的腹泻症状和改善内脏高敏感状态 这证实IBS -D 大鼠的内脏高敏感反应可通过艾灸来 改善，艾灸对1BS -D 大鼠的是有效的.与之前研 究结果相符n4_2n|。
脑肠互动是指大脑1彡胃肠道彼此之间的作用， 胃肠道将接收到的信息传递给(:N S 并进行调节的 过程，它的作川通过肠神经系统（ENS )局部调控、 椎前神经节、中枢神经系统（（:NS ) 3个层次调控 CN S 调控为大脑中枢和脊髓活动的信息被CNS 接 收，经过整合之后，调节信息直接作用于胃肠道效 应细胞或由神经系统和神经-内分泌系统传递给 ENS 1：大脑也能控制肠通透性，神经肽通过改 挎肠道屏障功能对宿卞：的神经元进行快速保护，这
95 T /预变性1 min ，然后95 变性20 S . 60 T ；退 火1 m in ，循环40次，反应获得数据。经2_&^'计箅 // 法和 Relative Quantil'iciilion Sliuly 分析方法得出 Orexin 及Ox 1R 的表达M 见表1
表1
各检测指标引物
基因
扩增片断正向引物反向引物长度(b n )(5'-3')
(5_~>3丨）O x l R 101GACTGCCAAGATGCTCATGG GGCGAAACATCCCAAACACT
O r e x i n
70(；ATCTCTCCGG A HCCCTCT GCCCAGGGAACCTITGTAGA 1.8 统计学方法
采用SPSS 21.0软件处理数据，符合正态分布用
均数±标准差（S ±.s ' )表示，组_织之间的差异采用 方差分析比较，若方差齐，用LSD 法事后分析，若方 差不齐，则使丨H Tamhtm ’s 法分析；配对样本f 检验用 于干预前后比较有统计学意义时设为P <〇.〇5 2 实验结果 2.1 稀便率
模型组和未干预的温和灸组稀便率相较于正 常组均明显升高（P <〇.〇l )；温和灸干预后，相较模 型组，温和灸组稀便率敁著下降（P <〇.〇l )，见图1
8〇i
：I _ 干预前
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就是应激性肠易激综合征等胃肠道疾病与肠道通透性改变相关的脑-肠相互作用。研究发现O r e x i n 分为两种，一种是O r e x i n-A，另一种是O r e x i n-15，O r e x i n-A对调节内脏感觉具有特异性，O r e x i n-A 的特异性受体O x i l i对O r e x i n-A有高度的亲和力，O x1K介导了O r e x i n-A引起的内脏感觉的改变，O x m参与了增强a w K的阈值容积|2V2S|。在胃肠功能方面，O r e x i n起着中枢调节胃分泌、胃肠运动和内脏感觉的作用O r f x i n神经纤维主要分布在C N S中，其中，被证明在疼痛调节中起作用的区域，如导水管周W灰质（P A G )和延髓头端腹内侧核（R V M )也受O r e x i n神经的支配.O r e x i n的外侧下丘脑通过P A G 和K V M在调节伤害性行为中起关键作用。在神经源性疼痛模式中，下丘脑受O m x i n-A刺激后产生镇痛作用，O r e x i n-A发挥中枢作爪，受脊髓背角O x1K 受体的调节，增强对结肠胀痛的抗伤害性反应，因此提示O r e x i n-A及O x丨R可能参与内脏感觉调节。结合本实验研究，模型组大鼠结肠和下丘脑的O r e x i n及O x1R表达相较正常组偏低；经温和灸干预后，温和灸组腹部冋缩的最小容量阈值回升，内脏敏感性降低，结肠和下丘脑的O r e x i n及O x1K的表达显著增高，表明温和灸对内脏感觉的镇痛作用可能是通过O r e x i n系统介导激活O x I K，二者参与内脏感觉调节。
本实验研究温和灸对I B S_D大鼠O r e x i n及其受体O x1R表达的影响，探讨影响内脏敏感性的可能作用机制与O r e x i n及O x1R的表达有关。当然，本实验也需要进一步去完善，如实验样本量少，且只检测了下丘脑和结肠组织中O m i»和O x l R的表达，其他相关炎症因子水平是否有改变仍需进一步研究。并 且研究发现O m x i n是一种神经递质，在外周器官组织和中枢神经系统中都广泛分布，然而也有少数报道称1_W|，胰岛细胞能分泌O r e x i n，O r e x i n是否作为一种激素发挥作用以及如何发挥作用，有待临床进行下一步研究。此外，O r e x i n和O x l R的表达与胃肠动力之间的作用关系，有待今后进一步研究，今后应开展大规模的临床研究，以评估温和灸在丨B S患者中的有效性，探讨出降低内脏敏感性的可能作用机制和作用靶点，以便于更好的指导临床潜方用药。
综上所述，温和灸“上巨虚”“天枢”穴I B S的镇痛作川机理可能是借助脑-肠轴的联系对O r e x i n的表达进行干预，通过脑-肠轴调控信息影响下丘脑和结肠的O r e x i n及O x l R的表达，从而改善肠内敏感性，参与调节内脏感觉♦
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