一种有效提高玉米赤霉烯酮内酯水解酶耐酸稳定性的固定化方法及应用

1.本发明涉及一种有效提高玉米赤霉烯酮内酯水解酶耐酸稳定性的固定化方法及应用，属于生物技术领域。

背景技术：

2.玉米赤霉烯酮(zearalenone,zen)，又被称为f-2毒素，主要由镰刀菌属微生物在其次级代谢过程中产生，是过去几年中分布最广泛的真菌毒素之一。zen主要存在于发霉的玉米、小麦和其他发霉的谷物中，通过食物链进入人体及动物体内后，因其具有与β-雌激素类似的酚二羟基内酯结构，它会竞争性地与β-雌激素受体结合，从而引发一系列的生殖毒性、遗传毒性、致癌性和免疫毒性。目前，许多生物学策略已被用于控制这种现象，其中玉米赤霉烯酮内酯水解酶(zen水解酶)是一种高效的生物降解工具，在生物降解zen方面表现出巨大潜力。然而，目前已鉴定的zen水解酶都表现出较差的酸性稳定性，在低ph条件下极易发生变性和失活。特别地，当暴露于高酸性胃液时，zen水解酶会失去全部活性。因此，本发明将开发一种制备水凝胶珠的固定化方法，当其暴露于高酸性环境时，可以保护zen水解酶免受酸诱导的失活。

技术实现要素：

3.本发明将来源于gliocladiumroseuma的zen水解酶(genbank accession number:ali16790.1)，与由卡拉胶和氢氧化镁(mg(oh)2)构成的缓释体系进行共封装，使得该zen水解酶的酸性稳定性得到显著提升，实现高酸性环境下对zen的高效降解。
4.本发明的第一个目的是提供一种制备固定化zen水解酶的方法，所述方法为：
5.s1、卡拉胶和mg(oh)2的共封装缓释体系的制备：
6.将粉末状卡拉胶溶解在超纯水中，在60℃下搅拌1h，然后在连续搅拌下将温度缓慢降至室温直至完全溶解，配制成浓度为2％(w/v)的卡拉胶水溶液，然后将mg(oh)2粉末加入卡拉胶水溶液中，继续搅拌30min至mg(oh)2均匀分布；
7.s2、zen水解酶粗酶液的获得：
8.在大肠杆菌中表达来源于粉红粘帚霉菌gliocladiumroseuma的zen水解酶，将重组大肠杆菌培养、诱导、破碎后收集细胞上清液即为zen水解酶粗酶液；
9.s3、水凝胶珠的制备：
10.将5ml玉米赤霉烯酮粗酶液加至s1制得的5ml混合液中，等比例进行混合，连续搅拌30min以进行共封装；使用1ml注射器将混合物注入10％氯化钾(kcl)溶液中，以制备水凝胶珠；形成的水凝胶珠于4℃条件下在kcl溶液中保持30min以促进水凝胶珠的硬化。
11.在一种实施方式中，将mg(oh)2粉末加入卡拉胶水溶液中配制成浓度为0.1％、0.2％、0.3％、0.4％的溶液。
12.优选地，配制成浓度为0.4％的溶液。
13.在一种实施方式中，所述zen水解酶的genbank:ali16790.1，将编码zen水解酶的基因连接至pet-22b(+)得到重组质粒。
14.在一种实施方式中，将来源于粉红粘帚霉菌gliocladiumroseuma的zen水解酶编码基因连接至表达载体pet-22b(+)得到重组质粒，将重组质粒通过化学转化至大肠杆菌bl21(de3)中，重组大肠杆菌在含有50mg/l氨苄的4ml液体lb培养基中于37℃培养过夜得到种子液。
15.在一种实施方式中，将种子液加至200ml含50mg/l的氨苄的lb液体培养基中扩大培养至od
600
为0.6-0.8，加入iptg(终浓度1mm)以在25℃下诱导蛋白质过表达6h。
16.在一种实施方式中，将诱导后的培养液以8000rpm离心2min收集菌体用于制备粗酶溶液；在菌体中加入20ml ph 7.0的细胞裂解液，重悬后置于超声细胞破碎机中超声破碎20min。
17.在一种实施方式中，超声处理后，细胞破碎液以8000r/min离心10min，最终用0.45μm微孔滤器过滤上清液得到粗酶溶液。
18.本发明的有益效果：
19.本发明使用注射凝胶法将zen水解酶封装在基于卡拉胶钾的水凝胶珠中，酶的酸稳定性通过与碱性缓冲剂mg(oh)2的共同封装得以提高。本发明所获得的mg(oh)2缓冲液在中性条件下是不溶的，但当氢离子扩散到水凝胶珠中时会溶解，从而确保中性的内部ph值。采用含有mg(oh)2缓冲剂的水凝胶珠共封装体系使得zen水解酶在酸性环境中的稳定性得到改善，适用于酸敏感酶的zen水解酶食品级递送系统，具有工业应用的潜力。
附图说明
20.图1为实施例1中由1ml注射器制备的水凝胶珠的形状及激光共聚焦显微镜图像。
21.图2为实施例3中共封装缓释体系中mg(oh)2含量对zen水解酶酶活的影响。
22.图3为实施例3中共封装缓释体系中koh含量对zen水解酶酶活的影响。
23.图4为实施例4中使用mg(oh)2共封装的缓释体系中固定化酶与游离酶的耐酸稳定性差异示意图。
具体实施方式
24.以下结合说明书附图和具体优选的实施例对本发明做进一步描述，但并不因此而限制本发明实施例中的技术方案进行清楚，完整的描述。
25.酶活及相对酶活的定义：
26.(1)酶活：单位时间内降解1μg zen所需要的酶量为1u。
27.(2)相对酶活：在最佳条件下(35℃，ph 7.0)的初始酶活被定义为100％，相对酶活为相对于初始酶活的残余酶活。
28.实施例1：zen水解酶水凝胶珠缓释体系的制备
29.步骤一、卡拉胶和mg(oh)2的共封装缓释体系的制备
30.将0.1g粉末状卡拉胶溶解在5ml超纯水中，在60℃下搅拌1h，然后在连续搅拌下将温度缓慢降至室温直至完全溶解，以制备2％(w/v)的卡拉胶水溶液。然后分别将不同质量的mg(oh)2粉末加入卡拉胶水溶液中，继续搅拌30min至mg(oh)2均匀分布。
31.步骤二、zen水解酶粗酶液及纯酶液的获得
32.(1)将来源于粉红粘帚霉菌gliocladiumroseuma(genbank accession number:ali16790.1)的zen水解酶编码基因连接至表达载体pet-22b(+)得到重组质粒。将重组质粒通过化学转化至大肠杆菌bl21(de3)中，重组大肠杆菌在含有50mg/l氨苄(amp)的4ml液体lb培养基中于37℃培养过夜。随后，将种子液加至200ml含50mg/l的氨苄的lb液体培养基中扩大培养至od
600
为0.6-0.8。此时，加入iptg(终浓度1mm)以在25℃下诱导蛋白质过表达6h。
33.(2)以8000r/min离心2min收集菌体用于制备粗酶溶液。在菌体中加入20ml ph为7.0的细胞裂解液，重悬后置于超声细胞破碎机中超声破碎20min。超声处理后，细胞破碎液以8000rpm离心10min，最终用0.45μm微孔滤器过滤上清液得到粗酶溶液。
34.(3)粗酶液以0.5ml/min的流速加载到histrap hp ni-nta柱上。使用缓冲液a(50mmpbs缓冲液、500mm nacl、50mm咪唑、ph 7.0)冲柱子以去除弱结合的蛋白质。随后，再使用洗脱缓冲液b(50mm pbs缓冲液，500mm nacl，500mm咪唑，ph 7.0)。
35.(4)纯化所得目的酶先在蛋白透析液a中透析2次(总时间不少于12h)去除杂质金属离子，再在蛋白透析液b中透析两次(总时间不少于12h)，收集至10ml ep管4℃备用。
36.步骤三、水凝胶珠的制备
37.将5ml zen水解酶粗酶液加至上述制得的5ml混合液中，连续搅拌30min进行共封装。使用1ml注射器将混合物注入10％kcl溶液中，以制备水凝胶珠(图1)。形成的水凝胶珠于4℃条件下在kcl溶液中保持30min以促进水凝胶珠的硬化。
38.实施例2：zen水解酶水凝胶缓释体系的活性测量
39.具体实施步骤如下：
40.(1)使用纯乙腈(99.9％)溶解zen粉剂(98％)制备zen标准溶液(4mg/ml)；
41.(2)总反应体积为250μl，其中包含水凝胶珠10颗、5μlzen标准溶液(4mg/ml)和245μl醋酸钠缓冲液(50mm，ph 4.0)；
42.对照组体系为20μl粗酶液(1mg/ml)、5μlzen标准溶液(4mg/ml)和240μl醋酸钠缓冲液(50mm，ph 4.0)。
43.在恒温摇床(200rpm，35℃)中孵育2h后加入750μl的甲醇以终止反应。
44.(3)为了检测反应体系中zen含量，将上述反应体系以10000rpm的离心速度离心2min，再将上清液用0.22μm的有机系针头式过滤器收集过滤后上清液。上清液通过高效液相谱(hplc)进行检测，检测条件为hypersil ods-c18柱(250
×
4.6mm，5μm)和紫外检测器。流动相为乙腈：水＝6:4；流速0.6ml/min；进样量：10μl；检测波长：254nm。
45.实施例3：不同mg(oh)2及koh含量对水凝胶珠缓释体系的影响
46.分别将mg(oh)2和koh粉末加入5ml2％(w/v)的卡拉胶水溶液中分别配制成0.1％、0.2％、0.3％、0.4％的浓度，在磁力搅拌器上搅拌30min；待粉末均匀分布后分别加入5ml粗酶液进行搅拌共封装，再使用1ml注射器将混合物注入10％kcl溶液中制备水凝胶珠。随后，分别在酸性环境ph 4.0及5.0条件下监测其酶活力，比较使用不同含量mg(oh)2和koh共封装后的相对酶活，选择酶活最高的一组为最佳固定条件。
47.结果如图2显示，在ph 5.0条件下，未共封装酸碱缓冲剂mg(oh)2的粗酶液活力仅剩15％左右。随着共封装mg(oh)2浓度的升高，酶活力逐渐提高，当mg(oh)2含量为0.4％时，水凝胶珠内的酶活性最高，在孵育2h后保持超过70％的活力。在ph 4.0条件下，未共封装mg
(oh)2的粗酶液活力低于5％；当mg(oh)2含量为0.4％时，水凝胶珠内的酶活性在孵育2h后仍保持约40％的活力。这表明水凝胶缓释系统可有效防止zen水解酶的酸变性，这是由于mg(oh)2使得水凝胶珠内部能够保持相对较高的ph环境，保护zen水解酶不受酸侵蚀的作用。
48.结果如图3显示，在ph 5.0及4.0条件下，未共封装koh的粗酶液活力仅剩15％和5％左右；随着共封装koh浓度的升高，酶活力无显著变化，仍维持在较低水平。这表明koh水凝胶缓释系统对zen水解酶的酸变性无显著效果，这是由于koh易溶于水，不能以固体形式封装于水凝胶珠内部，当处于较强酸性环境时，无法起到缓释作用，高浓度的氢离子仍会造成zen水解酶的酸变性。
49.实施例4：zen水解酶与mg(oh)2共封装水凝胶珠缓释体系的耐酸稳定性测定
50.(1)利用实施例3中优化的mg(oh)2含量，将0.4％的mg(oh)2粉末加入2％(w/v)的卡拉胶水溶液中，共封装zen水解酶纯酶液后制备水凝胶珠。
51.(2)分别将纯酶液(未封装)和水凝胶珠(已封装)在温度为35℃，ph为7.0、6.0、5.0、4.0条件下孵育20min，测定其残余酶活。
52.(3)记录各ph条件下的实验数据，得出二者的耐酸稳定性差异。
53.结果如图4显示，在ph 5.0条件下，未共封装mg(oh)2的纯酶液活力低于40％，而共封装0.4％的mg(oh)2时，水凝胶珠内酶活性超过80％。在ph 4.0条件下，纯粗酶液活力低于5％，共封装0.4％mg(oh)2的水凝胶珠内仍具有约40％的活力。
54.虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

技术特征：

1.一种制备固定化zen水解酶的方法，其特征在于，所述方法为：s1、卡拉胶和mg(oh)2的共封装缓释体系的制备：将粉末状卡拉胶溶解在超纯水中，配制成浓度为1～3％(w/v)的卡拉胶水溶液，再将mg(oh)2粉末加入卡拉胶水溶液中，搅拌均匀得到混合溶液，配制成浓度为0.1％～0.4％的溶液；s2、zen水解酶粗酶液的获得：将表达粉红粘帚霉菌(gliocladiumroseuma)来源的zen水解酶的重组大肠杆菌发酵产酶，得到粗酶液；s3、水凝胶珠的制备：将得到的粗酶液添加至s1得到的混合溶液中进行共封装，将共封装后的混合物注入氯化钾溶液中，制备水凝胶珠，在3～5℃条件下使水凝胶珠硬化。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述s1中将粉末状卡拉胶溶解在超纯水中，60℃下搅拌1h，配制成浓度为1～3％(w/v)的卡拉胶水溶液。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述s1为将mg(oh)2粉末加入卡拉胶水溶液中搅拌至mg(oh)2均匀分布。4.根据权利要求1～3任一所述的方法，其特征在于，将mg(oh)2粉末加入卡拉胶水溶液中配制成浓度为0.4％的溶液。5.根据权利要求1～4任一所述的方法，其特征在于，所述zen水解酶的genbank:ali16790.1，将编码zen水解酶的基因连接至质粒得到重组质粒，转入大肠杆菌中得到重组大肠杆菌。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，将得到的重组大肠杆菌培养至od
600
为0.6-0.8，加入终浓度1～2mm的iptg，在25～30℃下诱导6～12h。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，收集诱导后的细胞，向其中加入细胞裂解液，经超声破碎、过滤后得到粗酶液。8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，将粗酶液与s1制备得到的混合溶液的等比例混合。9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，连续搅拌25～30min以进行共封装，利用1ml注射器将混合物注入10％氯化钾溶液中。10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，形成的水凝胶珠于4℃条件下在氯化钾溶液中保持25～30min以促进水凝胶珠的硬化。

技术总结

本发明公开了一种有效提高玉米赤霉烯酮内酯水解酶耐酸稳定性的固定化方法及应用，属于生物技术领域。本发明使用注射凝胶法将ZEN水解酶封装在基于卡拉胶钾的水凝胶珠中，酶的酸稳定性通过与碱性缓冲剂Mg(OH)2的共同封装得以提高。本发明所获得的Mg(OH)2缓冲液在中性条件下是不溶的，但当氢离子扩散到水凝胶珠中时会溶解，从而确保中性的内部pH值。采用含有Mg(OH)2缓冲剂的水凝胶珠共封装体系使得ZEN水解酶在酸性环境中的稳定性得到改善，适用于酸敏感酶的ZEN水解酶食品级递送系统，具有工业应用的潜力。有工业应用的潜力。有工业应用的潜力。