近红外荧光探针天青A检测DNA

近红外荧光探针天青A 检测DNA

胡敏

1,2　张镇西31　沈国励3　刘娅莉31(西安交通大学生命学院，生物医学信息工程教育部重点实验室，生物医学工程研究所，西安710049)2

(西安交通大学理学院应用化学系，西安710049)3(湖南大学化学化工学院，化学生物传感器与计量学国家重点实验室，长沙410082)

摘　要　近红外荧光探针天青A (AZ )可与DNA 结合，结合常数为K =5.90×105L /mol，结合位点数n =0194

碱基对。利用在pH =8.0的tris 2HCl 缓冲体系中,DNA 浓度与天青A 的荧光强度呈线性关系，在近红外区建立测定核酸的方法。其检测下限为01064mg/L；线性范围为01064～26mg/L (r =019942)。本方法具有测试简单、背景干扰小、灵敏度高等优点。

关键词　天青A，近红外荧光探针，脱氧核糖核酸

　2006210218收稿;2006212220接受

本文系国家自然科学基金(No .20205005,20205004)和西安交通大学自然科学基金资助项目

3E 2mail:zxzhang@mail .xjtu .edu 1　引　言

荧光探针是一种利用荧光分子光学特征，在分子水平上研究一些体系物理、化学过程和检测某种特殊环境材料的结构及物理性质的方法。它具有灵敏度高和动态响应范围宽等特点，因而在生物大分子中应用广泛[1～3]。在近红外区生物分子自身荧光弱，背景干扰小，在此区域进行检测可获得较高灵敏

度。因此，近红外荧光探针的研究成为近年来的研究热点[4]。

DNA 为一种遗传物质，可与许多化合物如有机小分子、金属离子和蛋白质等[5]发生相互作用。用

荧光法研究DNA 时，由于DNA 的天然荧光较弱，须借助荧光探针。天青A (AZ )是一种吩噻嗪类染料，其最大吸收波长620nm ，荧光最大发射波长650n m ，摩尔吸光系数高，为一种近红外荧光探针。吩噻嗪类染料具有刚性的平面结构，可与DNA 相互作用[6]。Pasternack 等[7]报道,AZ 分子带正电荷可与DNA

带负电荷的磷酸骨架作用，同时其发基团与DNA 的碱基耦合。李园芳等[8]用共振光散技术建立了

RLS 法AZ 测定DNA 的新方法；訾言勤等[9]也用分子吸收光谱法研究AZ 与RNA 的作用方式。而利用

AZ 为近红外荧光探针建立DNA 的检测方法未见报道。

本研究利用天青A (AZ )可与DNA 发生相互作用，且DNA 浓度对天青A 的荧光猝灭呈线性关系，建立了以天青A 为近红外荧光探针，在近红外区测定脱氧核糖核酸的方法并取得满意效果。2　实验部分

2.1　仪器与试剂

M850型荧光分光光度计(日本);UV 21100紫外2可见分光光度计(北京瑞利分析仪器公司)。小牛

胸腺DNA (ct D NA )(华美生物工程公司)用10-2mol/L NaCl 溶液配制成1g/L 的水溶液，于0～4℃下保

存,UV 光谱测定A 2/A 1>1.8；天青A (上海试剂三厂)配制成1×10-4mol/L 的水溶液避光保存；溴化乙

锭(EB )(华美生物工程公司)配制成1×10-4

mol/L 水溶液。缓冲液为pH =8.0的tris 2HCl 。其它试剂均为分析纯。实验用水为二次蒸馏水。

有源带通滤波器2.2　实验方法

该边2.2.1　吸收光谱　于10mL 比管中加入1.0mL pH 8.0的tris 2HCl 缓冲溶液、一定量AZ 和ct D NA ，稀释至刻度，摇匀。以相应试剂空白作参比，在UV 21100紫外可见分光光度计上测其吸收光值。

2.2.2　荧光实验　于10mL 比管中加入1.0mL 不同pH 的tris 2HCl 缓冲溶液、一定量AZ 和ct D NA 第35卷2007年6月分析化学(FE NX I HUAXUE )　研究简报Chinese Journal of Analytical Che m istry 　

第6期890～892

稀释至刻度(或再加入其它试剂)，摇匀，测量荧光强度

。

　图1　天青A 吸收光谱Fig .1　Abs or p ti on of Azure A (AZ )AZ:10-5mol/L,DNA: 1.0mg/L;

2.15mg/L;

3.45mg/L.

3　结果与讨论

3.1　D NA 对AZ 吸收光谱的影响

在中性条件下,AZ 的最大吸收峰为620nm 。随着DNA 浓度

的增加,AZ 的特征吸收强度不断减小。DNA 对AZ 的吸收光谱

产生了明显的减效应，吸收峰发生红移。DNA 碱基与嵌入的有

机小分子产生电子相互作用，产生减效应，减程度与小分子

距DNA 碱基对间的距离的的3次方成反比[10]

。

即AZ 与DNA 碱基对距离很近，可能嵌入到DNA 的碱基对中，引起DNA 的碱基对与嵌入的AZ 分子间产生较强的电子相互作用(见图1)。3.2　D NA 对AZ 的荧光猝灭AZ 的最大激发和发射波长分别为620nm 和650n m 。在

　图2　NaCl 对AZ 2DNA 复合物荧光强度的影响

Fig .2　Effect of NaCl on the fluorescence intensity of AZ 2DNA comp lex

AZ:3×l0-6mol/L;DNA:10mg/L.的最大激发波长光照射下,AZ 的I 0/I 值随着ct D NA 的不断加入

逐渐增大，这说明DNA 分子与AZ 发生了作用，引起AZ 的荧光猝

灭。I 0/I 与DNA 的浓度呈直线关系，由此AZ 可作为检测DNA

的荧光探针。同时说明AZ 对DNA 的荧光猝灭符合经典猝灭理

论[11]，且AZ 的吸收光谱发生红移，因此,AZ 对DNA 的荧光猝灭

方式为静态猝灭即DNA 与AZ 的基态分子结合。

3.3　最佳pH 值选择

眼镜清洗剂

固定AZ 、DNA 的浓度，体系荧光强度受B ritt onRobins on 广泛缓冲介质pH 值影响，在pH =4～9时,

DNA 对AZ 的荧光猝灭变化率保持不变。磷酸缓冲液含有与DNA 链相同的磷酸根，因此，实验选择pH =8.0的tris 2HCl 缓冲体系。3.4　离子强度以强电解质NaCl 溶液研究离子强度对测量的影响(图2)。

实验结果表明，较高离子强度对AZ 的荧光强度基本没有影响。在天青2DNA 体系中，离子强度较低时，荧光强度增加较大。而达到一定浓度后，荧光强度变化小。由于离子强度对体系荧光强度有影响,

因　图3　Scatchard 图

Fig .3　Scatchard p l ot

r :C B /[ct 2DNA ];C B ：键合的荧光探针浓度(concen 2trati on of bonded fluoresent p r ob );C F ：游离的荧光探针浓度(concentrati on of free fluoresent p r ob );

AZ:3×10-6mol/L 。此，测量时需要严格控制离子强度。

3.5　AZ 与ct 2D NA 的结合常数及结合位点数的计算

校正曲线

AZ 与ct 2DNA 的结合常数K 及结合位点数n 按下列公

式计算[12]:

C B =C T -C F 　C F =C T (I /I 0-P )/(1-P )

其中,C F 为游离的荧光探针的浓度,C T 为所加的荧光

探针的浓度。I 与I 0分别为体系中存在DNA 和不存在

DNA 时的荧光强度。P 为体系中键合与未键合荧光探针的

荧光量子产率之比，即为I /I 0对l /[DNA ]作图，所得直线与

Y 轴的截距。C B 为键合的荧光探针的浓度。以r/C F 对r 作图得Scatchard p l ot (图3)，其中r =C B /[ct 2DNA ]，并按McGhee 和VonH i ppel 所给出的修正的Scatchard 方程[12]:

r/C F =K (1-n r ){(1-n r )/[1-(n -r )]}

n -1式中K 和n 是固定的内在结合常数和结合位点数。对此方程进行拟合，得K =5.90×105L /mol,n =0194。

198第6期胡　敏等：近红外荧光探针天青A 检测DNA 　

表1　样品测试结果(n =5)

Table 1　Deter m inati on results f or DNA (n =5)

DNA 样品Sa mp le

DNA 浓度Concentrati on of DNA (mg/L )测定值Found (mg/L )回收率Recovery (%)1

4.013 3.98697.52 3.003 3.030102.23：溴乙锭法测定(ethidium br om ide detecti on method )。3.6　

分析应用以AZ 的最大激发波长620n m 激发波长，并且在最大发射波长处测量。选用pH =8.0的tris 2HCl 缓冲体系，且保持一定的离子强度，温育3m in 后，对DNA 的试样进行检测。线性区间为

0.06～26mg/L，线性相关系数r =019942。2.0

mg/L DNA 连续测定6次的RS D 为3.7%。样品检测结果见表1。以天青A 为荧光探针，在近红外区测定核酸得满意效果。

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Near 2I nfrared Fluoresen t Probe of Azure A for

D eterm i n a ti on of D eoxyr i bonucle i c Ac i d

Hu M in

1,2,Zhang Zhen 2Xi 31,Shen Guo 2L i 3,L iu Ya 2L i 31(The Key L aboratory of B io m edical Infor m ation Engineering of M inistry of Education,

Institute of B io m edical Engineering,X i ′an J iaotong U niversity,X i ′an 710049)

(D epart m ent of A pplied Che m istry,School of Science,X i ′an J iaotong U niversity,X i ′an 710049)

3(S tate Key L aboratory for Che m o /B iosensing Technology and Che m o m etrics,College of Che m istry and

Che m ical Engineering,Hunan U niversity,Changsha 410082)Abstract A method with near 2I R as fl

uorensent p r obe of Azure A was devel oped f or the deter m inati on of DNA.The study results indicate that the DNA quenched the fluorescence of Azure A t o p r oduce the Azure A 2DNA comp lex .The binding constant of the interacti on bet w een the Azure A and DNA is,K =5190×105L /mol,and the binding site nu mbers n =0194base pairs .The detecti on li m it is 01064mg/L,and the linear range is 01064-26mg/L f or the deter m inati on of DNA.

Keywords Azure A ,near 2infrared fluoresent p r ob,doxyribonucleic acid

(Received 18Oct ober 2006;accep ted 20December 2006)298 分析化学

第35卷

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