微阵列芯片规模化生产的质检方法及制备方法与流程

1.本发明涉及一种微阵列芯片规模化生产的质检方法及制备方法，属于生物技术领域。

背景技术：

2.21世纪初，生物学发生了重大的变化，传统的生物学研究模式受到极大的挑战。随着“人类基因组计划”的迅速发展，生物数据的积累速度不断加快，也就对生物数据的科学分析方法与实用分析工具提出了更高的要求。在这样的背景下，利用数理知识、信息和计算机科学及技术的生物信息学应运而生，而在处理更为复杂的基因表达数据、更大的数据量及更快的数据增长的生物信息学里，微阵列芯片以其独特的信息挖掘成为一种高通量、平行化、微量化的高速生物分析手段，是研究的热点之一，是继大规模集成电路之后的又一次具有深远意义的科学技术革命，引起了广泛的重视。
3.微阵列芯片是通过点样机械装置在基底上面进行设计点样，将点样针吸取靶标溶液(如酶、抗原、抗体、受体、配体、核酸、细胞因子等)，然后移至基材上方，通过接触或非接触式的喷射，将靶标溶液固定在基材表面，后续处理后形成微阵列芯片。微阵列芯片是一种高通量的分析技术，根据靶标的特性，捕获能与之特异性结合的待测物(存在于血清、血浆、淋巴、间质液、尿液、渗出液、细胞溶解液、分泌液等)，经洗涤、纯化，再进行确认和生化分析；为获得重要生命信息(如未知蛋白组分、序列、体内表达水平生物学功能、与其他分子(如酶、抗原、抗体、受体、配体、细胞因子等)的相互调控关系、药物筛选、药物靶位的选择等)提供有力的技术支持，以用于研究靶标之间的相互作用，在疾病筛查、早期诊断以及筛选药物作用的靶点方面有突出的优势。
4.但是，在微阵列芯片的生产制备过程中，芯片结果的准确性是使用者密切关注的重点问题。因为微阵列芯片多数采用非接触式喷射点样，并且可视化微阵列芯片是通过靶标点的最终灰度值输出定量结果，因此靶标点的灰度值判定需要十分精确。而靶标点的灰度值与初期芯片点样过程中靶标点的面积有极大的关系。点样过程中，靶标点样面积均一，则保证后期实验结果重复性良好；反之，如果靶标点样面积出现大小不均一的现象，则明显影响结果的重复性和准确性。
5.在微阵列芯片的生产制备过程中，基材表面的均一性成为芯片成品质量的关键。但由于基材表面的特殊性及其后续需要在表面进行点样的特性，所以在基材表面质量检测的同时要保证表面的洁净不被污染且不受机械力破坏。
6.因此，前期用超纯水作为检测溶液以测定基材表面若干点位的接触角。用接触角的变化判定基材表面的均匀性。接触角是为设想在气、液、固三相交点处作气-液界面的切线，此切线与固体界面(液体侧)的夹角θ。
7.所以在图1所示接触角中，可知在固定点样体积的情况下，接触角一定，则表明液滴与固体表面的接触面积一定。则可通过用超纯水在微阵列基底表面喷射相同体积的液体，并且测定其接触角，以接触角度变化来判定基材表面的均匀性。同时采用超纯水操作，
无污染无机械破坏，仍能保证基材表面的生物性能。
8.但将接触角测定法应用于微阵列芯片生产过程中时，发现以下不足：(1)接触角测定仪单点测试或多点测试仍不能满足微阵列芯片所有靶标点处基材的均匀性，有一定程度的漏检概率；(2)用超纯水作为点样质检测试液进行点样，虽然避免了表面污染，但超纯水的表面张力和密度与真正的样品稀释液有差异，因此测试结果不能完全代表质检结果；(3)接触角测定属于动态测定，是液滴接触到固态表面瞬间形成的角度，排除了后续液体渗透及扩散的影响。但微阵列芯片靶标点最终是通过样品点面积与灰度值有直接关系，所以接触角测定不能概括后续液体扩散后的情况。
9.综上所述，现有公认的接触角测定法不能作为全面有效的微阵列芯片的质检方法。微阵列芯片制备时所采用的微阵列芯片质检方法在产品生产特别是大规模生产以及后期高精密度的定量检测结果的准确性上起着决定性的作用。因此，现有技术中需要一种能够应用于产业化、方便操作并且能确保能生产高质量的微阵列芯片的质检方法，以确保微阵列芯片的批间批内重复性良好，以便控制微阵列芯片的产品质量并有利于提高微阵列芯片产品检测结果的准确性。

技术实现要素：

10.为解决现有技术的不足，本发明提供了一种微阵列芯片规模化生产的质检方法，该质检方法能直接地完全概括点样仪的系统误差，点样液的密度、粘度及表面张力对结果带来的影响，质检后的纳米膜制备的微阵列芯片不仅实现了工业大规模化生产，还能够有效检验微阵列芯片表面的均匀性，以便控制纳米膜的质量并有利于提高蛋白质芯片产品的质量，缩小批内批间的差异，提高检测的准确度。
11.本发明的微阵列芯片规模化生产的质检方法，所述质检方法包括：
12.步骤1)将纳米膜置于洁净环境下，湿度＜20％、温度23℃～25℃条件下一段时间(例如20-28小时，优选24小时)使纳米膜充分平衡；
13.步骤2)配制点样液，现用现配；
14.步骤3)将步骤1)充分平衡后的纳米膜置于点样仪内，于湿度45％～55％、温度23℃～25℃的条件下用所述步骤2)所述点样液逐一点样于纳米膜的质检点，所述纳米膜的质检点为纳米膜的非靶标处、非质控点处和非空白对照处，每孔内质检点不少于2个，20nl/点；
15.步骤4)将步骤3)点样后的各纳米膜装入配套夹具，置于工业相机镜头下，调整镜头焦距至样品点清晰呈现且边缘明确，用工业相机逐孔拍照，用软件对各质检点进行直径测定并导出；
16.步骤5)分析纳米膜各质检点的直径数据，计算纳米膜上质检点直径的总体标准差、中位数和极差，总体标准差≤5％、中位数460μm～480μm、极差≤30μm为质检合格的纳米膜。这里的中位数的数值以及极差的数值是发明人通过大量实验获得的经验值。
17.本发明所述质检方法，是通过直接测定纳米膜上质检点的直径，计算纳米膜上质检点直径的总体标准差、中位数和极差，以此判定纳米膜表面的均匀性，并根据直径统计数据判断质检合格率及控制产品合格性能，可有效控制纳米膜生产全流程，提高生产工艺稳
定性和产品稳定性；以达到纳米膜最终点样制成芯片在检测生物样本过程中的重复性和准确度，使得最终检测值变异系数控制在15％以内甚至10％以内、回收率控制在80％～120％之间，远优于本领域技术人员通用的接触角测定法质检后纳米膜制备的微阵列芯片实际应用效果。
18.作为本发明的一种实施方式，步骤1)中使纳米膜充分平衡的所述时间为20～28小时，优选24小时。
19.作为本发明的一种实施方式，所述步骤2)中所述点样液为5％m/v甘油溶液、5％m/v山梨醇溶液、0.05％v/v曲拉通溶液、二甲基亚砜(dmso)溶液、pbs(ph6.8)溶液依次按体积比10∶15∶0.1∶50∶100混匀，现配现用。
20.本发明所述点样液可以完全体现真实点样过程中点样液的密度、粘度以及表面张力对结果的影响。
21.作为本发明的一种实施方式，所述步骤4)所述配套夹具包括盖板和底板，所述盖板设置有多个检测窗，所述底板在与所述检测窗的相应位置设置有镂空孔，所述盖板可压紧固定在所述底板上。所述步骤4)所述配套夹具优选为中国专利cn211348276u提及的配套夹具。
22.本发明还涉及一种微阵列芯片规模化生产的制备方法，包括：步骤(1)将质检合格的纳米膜置于容器中，加入15ml活化液进行表面活化，0.5小时后用纯化水将表面活化液冲洗干净后，用洁净空气吹干纳米膜表面；
23.步骤(2)将步骤(1)进行活化完毕的纳米膜置于点样仪内，按设定的程序将靶标用点样液稀释后作为靶标点点样液、羊抗鼠多抗或羊抗鼠二抗用点样液稀释后作为质控点点样液、空白对照点点样液分别点样于纳米膜，点样体积为20nl；
24.步骤(3)将步骤(2)点样后的各纳米膜装入配套夹具，置于温度21℃～25℃、湿度＜25％的条件下干燥6小时，用膜封闭液封闭后即为微阵列芯片。
25.本发明所述质检方法能直接地完全反映点样仪的系统误差，点样液的密度、粘度及表面张力对结果带来的影响，质检后的纳米膜制备的微阵列芯片不仅利于工业大规模化生产，还能够有效检验微阵列芯片表面的均匀性，以便控制纳米膜的质量并有利于提高蛋白质芯片产品的质量，缩小批内批间的差异，提高检测的准确度。
26.作为本发明微阵列芯片规模化生产制备方法的一种实施方式，所述步骤(1)中所述活化液为含5％m/v 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐edc、2.5％m/v n-羟基琥珀酰亚胺nhs的溶液。
27.作为本发明微阵列芯片规模化生产制备方法的一种实施方式，所述步骤(3)中所述膜封闭液为含1％w/v bsa、0.1％～0.5％v/v甘油、0.1％v/v tween-20的pbs溶液。
28.作为本发明制备方法的一种实施方式，所述步骤(2)的所述靶标为动物疫病病毒抗原或其蛋白或食品安全小分子抗原。
29.作为本发明的一种实施方式，所述步骤(2)中的所述靶标包括猪伪狂犬病病毒gd蛋白或ge蛋白、猪瘟病毒e2蛋白、猪口蹄疫病毒抗原、猪轮状病毒抗原、霉菌毒素抗原、禽用抗生素抗原。
30.作为本发明的一种优选实施方式，当微阵列芯片为猪伪狂犬病病毒gd、ge蛋白抗体二联检测芯片试剂盒中的猪伪狂犬病病毒gd、ge蛋白抗体二联检测芯片时，所述步骤(2)
的所述靶标为猪伪狂犬病病毒gd蛋白、ge蛋白。
31.当微阵列芯片为猪伪狂犬病病毒gd、ge蛋白、猪瘟病毒e2蛋白抗体三联检测芯片试剂盒中的猪伪狂犬病病毒gd、ge蛋白、猪瘟病毒e2蛋白抗体三联检测芯片时，所述步骤(2)的所述靶标为猪伪狂犬病病毒gd蛋白、ge蛋白及猪瘟病毒e2蛋白。
32.当微阵列芯片为o型、a型口蹄疫病毒抗体检测芯片试剂盒中的o型、a型口蹄疫病毒抗体检测芯片时，所述步骤(2)的所述靶标为o型口蹄疫病毒抗原、a型口蹄疫病毒抗原。
33.当微阵列芯片为真菌毒素四联检芯片试剂盒中的真菌毒素四联检芯片时，所述步骤(2)的所述靶标为伏马毒素抗原、黄曲霉毒素b1抗原、呕吐毒素抗原、玉米赤霉烯酮抗原。
34.本发明所述质检方法所制备的纳米膜可用于不用场景的试剂盒制备，包括但不限于动物源抗体的检测、食品安全小分子检测。
35.术语“微阵列芯片”(microarray chip)又称生物芯片(biochip)，是指采用光导原位合成或微量点样等方法，将大量生物大分子比如核酸片段、多肽分子、蛋白甚至组织切片、细胞等生物样品有序地固化于支持物(如纳米膜、玻片、硅片、聚丙烯酰胺、尼龙膜等载体)的表面，组成密集二维分子排列，然后与已标记的待测生物样品中靶分子反应，通过特定的仪器，比如激光共聚焦扫描仪或电荷偶联摄影像机对反应信号的强度进行快速、并行、高效地检测分析，从而判断样品中靶标分子的数量。
36.本发明中直径的总体标准差、中位数和极差如下：
37.术语“总体标准差”是总体各单位标志值与其算术平均数之间的平均离差，用σ表示。
38.术语“中位数”(median)又称中值，是按顺序排列的一组数据中居于中间位置的数，统计学中的专有名词，代表一个样本、种或概率分布中的一个数值，其可将数值集合划分为相等的上下两部分。
39.术语“极差”(range)，又称全距，是用来表示统计资料中的变异量数(measures of variation)，其最大值与最小值之间的差距，即最大值减最小值后所得之数据。
40.术语“回收率”是在测定样品的同时于样品中加入一定量的标准物质进行测定，将其测定结果扣除样品的测定值，而得到加入标准物质的回收率。其计算公式为：
41.回收率＝(加入标准物质的样品测得量-样品中该物质的测得量)/加入的标准物质量。
附图说明
42.参照以下附图将更好地了解本发明的上述与其他目的、特征、优点与实施例：
43.图1是接触角测量法中的接触角示意图；
44.图2为猪伪狂犬病病毒gd、ge蛋白抗体二联检测芯片试剂盒(简称试剂盒1)上每个芯片孔的点样模式示意图，图2中1a、1b、1c、1d、1e、1f、1g、1h、1i、1j分别表示了不同的点样模式，且在同一图中5、6在检测芯片上的具体位置可互换；
45.图3为猪伪狂犬病病毒gd、ge蛋白、猪瘟病毒e2蛋白抗体三联检测芯片试剂盒(简称试剂盒2)上每个芯片孔的点样模式示意图，图3中2a、2b、2c分别表示了不同的点样模式，且在同一图中5、6、7在检测芯片上的具体位置可互换；
46.图4为o型、a型口蹄疫病毒抗体检测芯片试剂盒(简称试剂盒3)上每个芯片孔的点
样模式示意图，图4中3a、3b、3c、3d、3e、3f、3g、3h、3i、3j分别表示了不同的点样模式，且在同一图中8、9在检测芯片上的具体位置可互换；
47.图5为真菌毒素四联检芯片试剂盒(简称试剂盒4)上每个芯片孔的点样模式示意图，图5中4a、4b、4c、4d、4e、4f、4g、4h、4i分别表示了不同的点样模式，且在同一图中10、11、12、13在检测芯片上的具体位置可互换。
48.附图标记1为质控点1、2为质控点2、3为质控点3、4为空白对照点、5为prvgd检测点、6为prvge检测点、7为csfv e2检测点、8为fmdv a检测点、9为fmdv o检测点、10为伏马毒素检测点、11为黄曲霉毒素b1检测点、12为呕吐毒素检测点、13为玉米赤霉烯酮检测点、*号为质检点。
具体实施方式
49.下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
50.本发明实施例中所用到的化学试剂均为分析纯，购自国药集团。
51.为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。本发明所述的实验方法，若无特殊说明，均为常规方法；所述的生物材料，若无特殊说明，均可从商业途径获得。
52.实施例1配制溶液
53.1.1配制点样液
54.5％甘油溶液的配制：精密称定5.00g甘油至100ml容量瓶中，加少量纯化水轻轻旋转使其溶解充分，避免产生过多气泡，再加纯化水至刻度线，上下翻转振摇10次，备用；
55.5％山梨醇溶液的配制：精密称定5.00g山梨醇至250ml烧杯中，加适量纯化水并搅拌使其完全溶解，再完全转移至100ml容量瓶中，加纯化水至刻度线，上下翻转振摇10次，备用；
56.0.05％曲拉通溶液的配制：用移液量取50μl曲拉通至100ml容量瓶中，加适量纯化水使其完全溶解，再加纯化水至刻度线，上下翻转振摇10次，备用；
57.dmso溶液：直接采用dmso试剂即可；
58.pbs(ph6.8)溶液配制：先配置0.2mol/l的磷酸氢二钠溶液和0.3mol/l的磷酸二氢钠溶液，再将两者按照49∶51的体积比进行混合，得到ph值为6.8的磷酸盐缓冲液；
59.将上述溶液按照10∶15∶0.1∶50∶100的体积比混合均匀，作为点样液。现配现用。
60.1.2配制膜封闭液
61.膜封闭液配方为含1％w/v bsa、0.1％～0.5％v/v甘油、0.1％v/v tween-20的pbs溶液，按膜封闭液配方配制。
62.1.3配制活化液
63.将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(简称edc)按5％m/v、n-羟基琥珀酰亚胺(简称nhs)按2.5％m/v于纯化水中充分混匀，作为活化液。
64.实施例2微阵列芯片规模化生产的质检方法及制备方法的建立
65.2.1质检方法的操作步骤
66.微阵列芯片规模化生产的质检方法，所述质检方法包括：
67.步骤1)将纳米膜置于洁净环境下，湿度＜20％、温度23℃～25℃条件下24小时使纳米膜充分平衡；
68.步骤2)配制点样液，现用现配；
69.步骤3)将步骤1)充分平衡后的纳米膜置于点样仪内，于湿度45％～55％、温度23℃～25℃的条件下用所述步骤2)所述点样液逐一点样于纳米膜的质检点，所述纳米膜的质检点为纳米膜的非靶标处、非质控点处和非空白对照处，每孔内质检点不少于2个，20nl/点；
70.步骤4)将步骤3)点样后的各纳米膜装入配套夹具，置于工业相机镜头下，调整镜头焦距至样品点清晰呈现且边缘明确，用工业相机逐孔拍照，用软件对各质检点进行直径测定并导出；
71.步骤5)分析纳米膜各质检点的直径数据，计算纳米膜上质检点直径的总体标准差、中位数和极差，总体标准差≤5％、中位数460μm～480μm、极差≤30μm为质检合格的纳米膜。
72.质检合格的纳米膜可立即使用，也可分别放置于自封袋中于室温存放备用。
73.2.2微阵列芯片规模化生产的制备方法的操作步骤
74.微阵列芯片规模化生产的制备方法，所述步骤包括：
75.步骤(1)将实施例2.1质检合格的纳米膜置于容器中，加入适量活化液进行表面活化，0.5小时后用纯化水将表面活化液冲洗干净后，用洁净空气吹干纳米膜表面；
76.步骤(2)将步骤(1)进行活化完毕的纳米膜置于点样仪内，按设定的程序将靶标用点样液稀释后作为靶标点点样液、羊抗鼠多抗或羊抗鼠二抗用点样液稀释后作为质控点点样液、空白对照点点样液分别点样于纳米膜，点样体积为20nl；
77.步骤(3)将步骤(2)点样后的各纳米膜装入配套夹具，置于温度21℃～25℃、湿度＜25％的条件下干燥6小时，用膜封闭液封闭后即为微阵列芯片。
78.当微阵列芯片为猪伪狂犬病病毒gd、ge蛋白抗体二联检测芯片试剂盒上的每个芯片时为图2所示，靶标点为图2所示5、6，5为prvgd检测点、6为prvge检测点。
79.当微阵列芯片为猪伪狂犬病病毒gd、ge蛋白、猪瘟病毒e2蛋白抗体三联检测芯片试剂盒上的每个芯片时为图3所示，靶标点为图3所示5、6、7，5为prvgd检测点、6为prvge检测点、7为csfv e2检测点。
80.当微阵列芯片为o型、a型口蹄疫病毒抗体检测芯片试剂盒上的每个芯片时为图4所示，靶标点为图4所示8、9，8为fmdv a检测点、9为fmdv o检测点。
81.当微阵列芯片为真菌毒素四联检芯片试剂盒上的每个芯片时为图5所示，靶标点为图5所示10、11、12、13，10为伏马毒素检测点、11为黄曲霉毒素b1检测点、12为呕吐毒素检测点、13为玉米赤霉烯酮检测点。
82.2.3质检方法的验证
83.为更好地评价质检方法，本发明以真菌毒素四联检芯片试剂盒(简称试剂盒4)为例对质检方法的验证进行详细的阐述。其中，试剂盒4中的真菌毒素四联检芯片用点样液稀
释使伏马毒素抗原按0.6ng/点点样于伏马毒素检测点，用点样液稀释使黄曲霉毒素b1抗原按0.8ng/点点样于黄曲霉毒素b1检测点，用点样液稀释使呕吐毒素抗原按0.7ng/点点样于呕吐毒素检测点，用点样液稀释使玉米赤霉烯酮抗原按0.4ng/点点样于玉米赤霉烯酮检测点，用点样液稀释使羊抗鼠多克隆抗体按1ng/点点样于质控点1，用点样液稀释使羊抗鼠多克隆抗体按2ng/点点样于质控点2，用点样液稀释使羊抗鼠多克隆抗体按4ng/点点样于质控点3，用点样液点样于空白对照点。
84.试剂盒4的检测步骤如下：
85.(4-1)样品前处理，用粉碎机将粮食、饲料原料或成品饲料样品粉碎至20目(约1mm粒度)以下，准确称取2
±
0.02g样品于50ml离心管中，加入10ml样品提取液，将样品充分混匀后涡旋5分钟，4000转/分钟离心5分钟，取50μl上清液加入到950μl样品稀释液中混匀，取50μl进行检测；
86.(4-2)平衡，将试剂盒各组分置室温平衡30分钟；
87.(4-3)浸润，在微阵列芯片的每孔加入250μl洗涤液(每孔约4～5滴)，静置浸润3分钟，甩掉并拍干孔内液体；
88.(4-4)加样，分别在微阵列芯片的每孔中加入50μl样品、25μl酶标工作液和25μl抗体工作液，
89.(4-5)孵育，在微孔板恒温振荡器中30℃500转/分钟，振荡孵育20分钟；
90.(4-6)洗涤，弃掉孔内液体，每孔加入250μl洗涤液(每孔约4～5滴)，注意不要使洗涤液溢出孔外，避免引起交叉污染导致检测结果不准确，洗涤4次，每次浸泡约10秒，在吸水纸上拍干；
91.(4-7)显，每孔加入100μl tmb底物液，在微孔板恒温振荡器中30℃静置显15分钟；
92.(4-8)读数，甩掉液体，打开配套夹具(参见中国专利cn211348276u)，用无尘纸适度按压芯片，吸干芯片膜面的液体，用微孔盘芯片影像仪检测，需在5分钟内完成读数，查看检测结果。
93.实施例3不同质检方法质检所得纳米膜制备芯片结果的比较
94.本发明以本发明方法和接触角测定法进行比较。
95.本发明方法及合格标准：实施例2.1中所述质检方法、实施例2.2中所述制备方法及合格标准；
96.接触角测定法及合格标准：用接触角测定仪对纳米膜表面接触角度进行测定。每块纳米膜随机选取10个点进行测定，采用纯水作为接触角测定液。每块纳米膜10个接触角数据极差≤2％，即判定纳米膜合格。
97.3.1不同质检方法质检所得纳米膜制备芯片后准确性和重复性结果的比较
98.将1批纳米膜(180块/批)平均分配，按实施例2.1、按附图5中的点样方式选任意2点作为质检点，分别用上述两种方法进行质检并挑选符合对应质检标准规定的纳米膜作为备用纳米膜。
99.再将上述两种方法质检后合格的备用纳米膜分别按实施例2.1所述制备真菌毒素四联检芯片，除所使用的纳米膜为不同方法检测外，其他操作步骤均保证一致。将制备后的芯片按照“本发明方法”和“接触角测定法”进行分类标识，并随机抽取三名实验员进行实
验，一人同时操作两块芯片(不同方法各一块)，将最终结果按照准确性和重复性进行分析比较。
100.经gb5009.22-2016中的液相谱-串联质谱法测定样品中的黄曲霉毒素b1(简称afb1)、gb5009.22-2016中的液相谱-串联质谱法测定样品中的脱氧雪腐镰刀菌烯醇(简称don)、gb5009.209-2016中的液相谱法测定样品中的玉米赤霉烯酮(简称为zen)、gb5009.240-2016中的液相谱法测定样品中的伏马毒素(简称为fb)四种方法检测后的均为阴性的样品，添加afb1、don、zen、fb标准品后，按照下列前处理方法进行处理：用粉碎机将样品粉碎至20目(约1mm粒度)以下；准确称取2
±
0.05g均质后的组织样品于50ml聚苯乙烯离心管中，加入10ml样品提取液，充分涡旋5分钟，将样本混合分散后；室温下于4000转/分钟离心5分钟；取50μl上层清液，加入到950μl样品稀释液中混匀。准确性则以回收率作为标准，重复性则以同浓度下灰度值的变异程度(cv值)作为标准。结果见表1：
101.表1两种方法检测结果汇总
102.表1结果显示：经过本发明方法筛选合格的纳米膜，其中纳米膜上的质检点直径总体标准差≤5％、中位数460μm～480μm、极差
±
30μm，在准确性(以回收率为判定结果，在86％～113％之间)和重复性(≤6％)两方面都有明显提升，较接触角测定法筛选的纳米膜在性能上(回收率在61％～143％之间、重复性＞15％)有了明显改善。
103.3.2不同批次纳米膜制备芯片的结果比较
100.将3批纳米膜(180块/批，选取连续3批共计540块)每批平均分配，按实施例2.1、按图5中的点样方式选任意2点作为质检点，分别用上述两种方法进行质检并挑选符合对应质检标准规定的纳米膜作为备用膜。
101.将上述两种方法质检后合格的备用纳米膜分别按实施例2.1所述制备真菌毒素四联检芯片；除所使用的纳米膜为不同方法检测外，其他操作步骤均保证一致。将制备后的芯片按照“本发明方法”和“接触角测定法”进行分类标识，并随机抽取三名实验员进行实验，一人每次试验同时操作两块芯片(不同方法各一块)，将最终结果按照准确性和重复性进行分析比较。准确性以回收率进行判定，重复性则以同浓度下灰度值的变异系数(cv值)进行判定。结果见表2：
102.表2不同批次纳米膜制备芯片检测结果的比较
103.表2结果显示：经过本发明方法质检筛选合格的纳米膜，经测定纳米膜上的质检点直径总体标准差≤5％、中位数460μm～480μm、极差
±
30μm，且不同批次间的重复性和准确性都相对稳定，回收率范围集中在85％～115％之间，批间重复性≤8％，而接触角测定法质
检筛选合格的纳米膜，在重复性(在47％～134％之间)和准确性(＞15％)表现均欠佳。因此，本发明方法优于传统的接触角测定法。
104.3.3用不同方法筛选的纳米膜针对不同项目的实验结果
105.将1批纳米膜(180块/批)每批平均分配，分别用上述两种方法进行质检并挑选符合对应质检标准规定的纳米膜作为备用膜。
106.将上述两种方法质检后合格的备用膜分别按实施例2.1所述制备猪伪狂犬病病毒gd、ge蛋白抗体二联检测芯片(表3中简称二联芯片)和猪伪狂犬病病毒gd、ge蛋白、猪瘟病毒e2蛋白抗体三联检测芯片(表3中简称三联芯片)；除去所使用的纳米膜为不同方法检测外，其他操作步骤均保证一致。将制备后的芯片按照“本发明方法”和“接触角测定法”进行分类标识，并随机抽取三名实验员进行实验，一人每次试验同时操作两块芯片(不同方法各一块)，将最终结果按照重复性进行分析比较。重复性则以同浓度下灰度值的变异程度(cv值)作为标准。结果见表3：
107.表3用不同方法筛选的纳米膜针对不同项目的实验结果
108.表3结果显示：在动物疫病芯片方向，仍然呈现本发明方法筛选的纳米膜性能(重复性为4％～8％)明显优于接触角测定法筛选的纳米膜性能(重复性≥15％)，因此，本发明方法优于传统的接触角测定法。
109.3.4纳米膜质检点个数的检测
110.对每块纳米膜质检点个数进行检测，以验证点样个数多少合适。
111.随机选取1批纳米膜，按实施例2.1、按附图5中的点样方式选任意2点、3点、4点、5点、6点、7点、8点作为质检点。将制备后的芯片按照“本发明方法”和“接触角测定法”进行分类标识，并随机抽取三名实验员进行实验，一人每次试验同时操作两块芯片(不同方法各一块)，将最终结果按照准确性和重复性进行分析比较。准确性则以结果的回收率作为标准，重复性则以同浓度下灰度值的变异程度(cv值)作为标准，结果见表4：
112.表4纳米膜质检点个数的检测结果
从表4可以看出，本发明方法质检时质检点个数的选择对于回收率和重复率没有实质影响。
113.实施例4不同质检方法规模化生产微阵列芯片的应用
114.4.1真菌毒素四联检芯片试剂盒的应用
115.取临床样品40份(编号1#～40#)，按国标方法和本发明方法分别进行检测。
116.将1#～10#的10份样品按国标方法gb5009.22-2016中的液相谱-串联质谱法测定样品中的黄曲霉毒素b1(简称afb1)。
117.将11#～20#的10份样品按国标方法gb5009.22-2016中的液相谱-串联质谱法测定样品中的脱氧雪腐镰刀菌烯醇(简称don)。
118.将21#～30#的10份样品按国标方法gb5009.209-2016中的液相谱法测定样品中的玉米赤霉烯酮(简称为zen)。
119.将31#～40#的10份样品按国标方法gb5009.240-2016中的液相谱法测定样品中的伏马毒素(简称为fb)。
120.同时将40份样品按照下列前处理方法进行处理：用粉碎机将样品粉碎至20目(约1mm粒度)以下；准确称取2
±
0.05g均质后的组织样品于50ml聚苯乙烯离心管中，加入10ml样品提取液，充分涡旋5分钟，将样本混合分散后；室温下于4000转/分钟离心5分钟；取50μl
上层清液，加入到900μl样品稀释液中混匀。
121.按实施例2.1、按附图5中的点样方式选任意2点作为质检点，分别用上述两种方法进行质检并挑选符合对应质检标准规定的纳米膜，制备成试剂盒4，按“本发明方法”和“接触角测定法”进行分类标识，并随机抽取三名实验员进行实验，一人每次试验同时操作两块芯片(不同方法各一块)。按实施例2.2中试剂盒4的检测步骤检测处理后的样品，将最终结果按准确性和与国标方法对比进行分析比较。重复性则以同浓度下灰度值的变异程度(cv值)作为标准。检测值及回收率结果如表5所示，批内批间重复性如表6所示。
122.结果显示：本发明方法检测后的回收率结果在82.63％-114.18％，批内批间重复性均小于13％，临床样品准确性及重复性均较好，均优于接触角法测定的结果。
123.表5本发明方法检测值及回收率结果
124.表6批内批间重复性结果
125.4.2猪伪狂犬病病毒gd、ge蛋白抗体二联检测芯片试剂盒的应用
126.按实施例2.1、按图2中的点样方式选任意3点作为质检点，分别用上述两种方法进行质检并挑选符合对应质检标准规定的纳米膜，再制备猪伪狂犬病病毒gd、ge蛋白抗体二联检测芯片试剂盒(简称试剂盒1)中的猪伪狂犬病病毒gd、ge蛋白二联检抗体检测芯片，其中猪伪狂犬病病毒gd、ge蛋白二联检抗体检测芯片中用点样液稀释使猪伪狂犬病病毒gd蛋白按4.0ng/点点样于prvgd检测点，用点样液稀释使猪伪狂犬病病毒ge蛋白按1.0ng/点点样于prvge检测点，用点样液稀释使羊抗鼠多克隆抗体按1ng/点点样于质控点1，用点样液稀释使羊抗鼠多克隆抗体按2ng/点点样于质控点2，用点样液稀释使羊抗鼠多克隆抗体按4ng/点点样于质控点3，用点样液点样于空白对照点。
127.猪伪狂犬病病毒gd、ge蛋白抗体二联检测芯片试剂盒(简称试剂盒1)检测方法如下：(1-1)平衡，将试剂盒各组分置室温平衡30分钟；
(1-2)浸润，在微阵列芯片的每孔加洗涤液300μl/孔，浸润3分钟后弃液、拍干；(1-3)加样，加样品稀释液50μl/孔后加待检样品50μl/孔，置恒温振荡孵育器37℃、500转/分钟温育30分钟；弃液，加洗涤液300μl/孔，浸泡30～60秒，弃液；反复洗涤5遍，最后一次拍干；(1-4)加酶标试剂，加入酶标试剂100μl/孔，置恒温振荡孵育器37℃、500转/分钟温育30分钟；弃液，加洗涤液300μl/孔，浸泡30～60秒，弃液；反复洗涤5遍，最后一次拍干；(1-5)显，加入底物液100μl/孔，置37℃温育15分钟后弃液、拍干；(1-6)测定，去芯片上盖后，将无尘纸置检测芯片上，轻轻按压，并于10分钟内用微孔盘芯片影像仪测定结果，导出s/n值(样品s值/质控点n值)。
128.试验有效性判定：质控点s值应≥6000、空白对照点s值应≤3000，否则试验无效，该判定通过内部数据处理分析系统自行完成。结果判定(该判定也通过内部一键式智能化数据处理分析系统自行完成，不需要技术人员再进行数据运算及统计分析)标准如下：
129.s/n比率的计算：s/n＝样品a值/阴性质控品a值(其中样品a值为样品检测灰度值；阴性质控品a值即某一质控点检测灰度值，该质控点根据该批调试时已标定的已知阴性阳性的样品的分析值与标准值符合情况优选而出。优选标准为已标定的已知阴性阳性的样品与三个质控品点1、2、3的灰度值比值计算的结果，与标准值及判定结果的吻合度最高的条件对应的质控品点)。
130.阳性判定s/n≤0.600时prv gd、ge抗体为阳性；
131.阴性判定s/n＞0.700时prv gd、ge抗体为阴性；
132.可疑0.600＜s/n≤0.700时prv gd、ge抗体为可疑，需重新取样进行检测，若检测仍为可疑则判为阴性。
133.收集经猪伪狂犬病病毒中和试验及商品化猪伪狂犬病毒elisa抗体试剂盒(包括biochek prvgb试剂盒、idexx prvge试剂盒测定结果为阴性)、猪瘟病毒elisa抗体试剂盒(经idexx csfv抗体检测试剂盒测定)检测的临床样品10份阳性样品(编号：41#～50#，prvgd抗体、prvge抗体均为阳性，其中41#～45#csfv抗体也为阳性)、10份阴性样品(编号：51#～60#，prvgd抗体、prvge抗体均为阴性)。
134.任选3批(批号标记为a、b、c)纳米膜分别制备成试剂盒1，按“本发明方法”和“接触角测定法”进行分类标识，并随机抽取三名实验员进行实验，一人每次试验同时操作3批中任一块芯片以进行批间重复性测定，并随机选取1批中任3块以进行批内重复性测定，同时将接触角测定法制备的试剂盒进行对比。按实施例4.2中试剂盒1的检测步骤检测20份临床样品，将最终结果按重复性和与接触角测定法对比进行分析比较，两种方法批内批间重复性结果如表7所示，特别地本发明方法质检的纳米膜制备的试剂盒检测结果与商品化试剂盒检测结果一致性优于接触角测定法的。而且本发明方法质检的纳米膜制备的试剂盒1检测prvgd抗体、prvge抗体的批间、批内变异系数均在5％以内，而接触角测定法质检的纳米膜制备的试剂盒1检测prvgd抗体、prvge抗体的批间、批内变异系数均在8％～15％，因此本发明方法质检的效果优于接触角测定法质检的效果。
135.表7不同方法质检的纳米膜制备的试剂盒检测结果对比
136.4.3猪伪狂犬病病毒gd、ge蛋白、猪瘟病毒e2蛋白抗体三联检测芯片试剂盒的应用
137.按实施例2.1、按图3中的点样方式选任意2点作为质检点，分别用上述两种方法进行质检并挑选符合对应质检标准规定的纳米膜，再制备猪伪狂犬病病毒gd、ge蛋白、猪瘟病毒e2蛋白抗体三联检测芯片试剂盒(简称试剂盒2)中的猪伪狂犬病病毒gd、ge蛋白及猪瘟病毒e2蛋白三联检抗体检测芯片，其中猪伪狂犬病病毒gd、ge蛋白及猪瘟病毒e2蛋白三联检抗体检测芯片中用点样液稀释使猪伪狂犬病病毒gd蛋白按4.0ng/点点样于prvgd检测点，用点样液稀释使猪伪狂犬病病毒ge蛋白按1.0ng/点点样于prvge检测点，用点样液稀释使猪瘟病毒e2蛋白按6.4ng/点点样于csfv e2检测点，用点样液稀释使羊抗鼠多克隆抗体按1ng/点点样于质控点1，用点样液稀释使羊抗鼠多克隆抗体按2ng/点点样于质控点2，用点样液点样于空白对照点。
138.猪伪狂犬病病毒gd、ge蛋白、猪瘟病毒e2蛋白抗体三联检测芯片试剂盒(简称试剂盒2)检测方法按试剂盒1的检测方法进行，并在试剂盒1判定方法的基础上增加猪瘟抗体的判定方法，猪瘟抗体的判定方法如下：pi＝(1-样品a值/阴性质控品a值)
×
100％。pi≥40％判定为csfv抗体阳性；30％＜pi＜40％判定为csfv抗体可疑；
pi≤30％判定为csfv抗体阴性。
139.按实施例2.1、按附图3中的点样方式选任意2点作为质检点，分别用上述两种方法进行质检并挑选符合对应质检标准规定的纳米膜，任选3批(批号标记为a、b、c)纳米膜分别制备成试剂盒2，按“本发明方法”和“接触角测定法”进行分类标识，并随机抽取三名实验员进行实验，一人每次试验同时操作3批中任一块芯片以进行批间重复性测定，并随机选取1批中任3块以进行批内重复性测定，同时将接触角测定法制备的试剂盒进行对比。按实施例4.3中试剂盒2的检测步骤检测20份临床样品，将最终结果按重复性和与接触角测定法对比进行分析比较，两种方法批内批间重复性结果如表8～9所示，特别地本发明方法质检的纳米膜制备的试剂盒检测结果与商品化试剂盒检测结果一致性优于接触角测定法的。而且本发明方法质检的纳米膜制备的试剂盒2检测prvgd抗体、prvge抗体及csfv抗体的批间、批内变异系数均在5％以内，而接触角测定法质检的纳米膜制备的试剂盒2检测prvgd抗体、prvge抗体及csfv抗体的批间、批内变异系数均在8％～15％，因此本发明方法质检的效果优于接触角测定法质检的效果。
140.表8本发明方法质检的纳米膜制备的试剂盒检测结果对比表8本发明方法质检的纳米膜制备的试剂盒检测结果对比
141.表9接触角测定法质检的纳米膜制备的试剂盒检测结果对比
142.4.4o型、a型口蹄疫病毒抗体检测芯片试剂盒的应用
143.按实施例2.1、按图4中的点样方式选任意2点作为质检点，质检合格后再制备o型、a型口蹄疫病毒抗体检测芯片试剂盒(简称试剂盒3)中的o型、a型口蹄疫病毒抗体检测芯片，其中o型、a型口蹄疫病毒抗体检测芯片中用点样液稀释使o型口蹄疫病毒抗原按16ng/点点样于fmdv o检测点，用点样液稀释使a型口蹄疫病毒抗原按32ng/点点样于fmdv a检测点，用点样液稀释使羊抗鼠多克隆抗体按2ng/点点样于质控点1，用点样液稀释使羊抗鼠多克隆抗体按4ng/点点样于质控点2，用点样液稀释使羊抗鼠多克隆抗体按6ng/点点样于质控点3，用点样液点样于空白对照点。
144.o型、a型口蹄疫病毒抗体检测芯片试剂盒(简称试剂盒3)的检测方法如下：(3-1)样品预稀释，将血清样品用样品稀释液10倍稀释；(3-2)编号，将芯片孔按样品顺序编号；(3-3)浸润，加洗涤液300μl/孔，浸润3分钟后弃液、拍干；(3-4)加样，加稀释后的样品50～100μl/孔，置恒温振荡器37℃、500转/分钟温育30分钟；(3-5)加酶标试剂，加入酶标试剂50～100μl/孔，置恒温振荡器37℃、500转/分钟温育30分钟；弃液，加洗涤液300μl/孔，浸泡10～20秒，弃液，反复洗涤5遍，最后一次拍干；(3-6)显，加入底物液100μl/孔，置37℃温育15分钟；(3-7)测定，垂直弃液，甩净，去芯片上盖后，倒扣至无尘纸上，轻轻按压，并于10分钟内用微孔盘芯片影像仪测定结果，导出阻断率(1-样品灰度值/质控点灰度值)。
145.试验有效性判定：质控点灰度值应≥10000、空白对照点灰度值应≤3000，否则试验无效，该判定通过内部数据处理分析系统自行完成。结果判定(该判定也通过内部一键式智能化数据处理分析系统自行完成，不需要技术人员再进行数据运算及统计分析)标准如下：阻断率的计算：阻断率＝(1-样品灰度值/质控点灰度值)
×
100％阳性判定：阻断率≥50％时fmdv o、a抗体为阳性；阴性判定：阻断率＜50％时fmdv o、a抗体为阴性。
146.收集经商品化口蹄疫病毒elisa抗体试剂盒(包括兰兽研口蹄疫病毒o型抗体液相阻断elisa检测试剂盒、兰兽研口蹄疫病毒a型抗体液相阻断elisa检测试剂盒)检测的临床样品10份阳性样品(编号：61#～70#，fmdv o型、a型抗体均为阳性)、10份阴性样品(编号：71#～80#，fmdv o型、a型抗体均为阴性)。
147.按实施例2.1、按图4中的点样方式选任意3点作为质检点，分别用上述两种方法进行质检并挑选符合对应质检标准规定的纳米膜，任选3批(批号标记为a、b、c)纳米膜分别制备成试剂盒3，按“本发明方法”和“接触角测定法”进行分类标识，并随机抽取三名实验员进行实验，一人每次试验同时操作3批中任一块芯片以进行批间重复性测定，并随机选取1批中任3块以进行批内重复性测定，同时将接触角测定法制备的试剂盒进行对比。按实施例4.4中试剂盒3的检测步骤检测20份临床样品，将最终结果按重复性和与接触角测定法对比进行分析比较，两种方法批内批间重复性结果如表10所示，特别地本发明方法质检的纳米膜制备的试剂盒检测结果与经商品化口蹄疫病毒elisa抗体试剂盒检测结果一致性优于接触较测定法的。而且本发明方法质检的纳米膜制备的试剂盒3检测fmdv o型抗体、a型抗体的批间、批内变异系数均在5％以内，而接触角测定法质检的纳米膜制备的试剂盒3检测检测fmdv o型抗体、a型抗体的批间、批内变异系数均在7％～15％，因此本发明方法质检的效果优于接触角测定法质检的效果。
148.表10不同方法质检的纳米膜制备的试剂盒检测结果对比
149.综上所述，本发明质检方法可以将点样过程在质检过程中重现，规避点样过程中带入的系统误差，真正体现纳米膜的制备工艺的稳定性和均匀性。样品点直径的测定方式在最大程度上体现了纳米膜表面的均匀性，通过上述质检方法的纳米膜，在后续的芯片制备过程中均表现出优良的实验结果。并且此质检方法固着于纳米膜表面的点样溶液，可以在制备芯片的环节中，通过纳米膜这个环节彻底洗净，无残留，对纳米膜表面无影响。
150.高通量微阵列芯片项目是通过点样，将蛋白等靶标固定于纳米膜表面，最终通过酶联免疫法和显反应，使得对应样品点产生蓝沉淀，并通过读取灰度值判定最终结果。因此，样品点的大小均匀性成为微阵列芯片尤其是定量判定的微阵列芯片的质量关键。
151.纳米膜作为微阵列芯片的主要基材，并且作为蛋白等靶标的载体，其表面均匀性对芯片质量起着决定性作用。又因其主要成分为硅胶的这个特点，纳米膜本身的质检方法成为质量控制的难点。目前没有合适、有效且满足工业生产的仪器质检方法可以用于纳米膜的质检，因此，本发明从点样出发，将整个点样过程加入纳米膜的质检过程，全面控制纳米膜表面的均匀性，为微阵列芯片的质量控制提供有力保障。
152.以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：

1.一种微阵列芯片规模化生产的质检方法，所述质检方法包括：步骤1)将纳米膜置于洁净环境下，湿度＜20％、温度23℃～25℃条件下一段时间使纳米膜充分平衡；步骤2)配制点样液，现用现配；步骤3)将步骤1)充分平衡后的所述纳米膜置于点样仪内，于湿度45％～55％、温度23℃～25℃的条件下用所述步骤2)所述点样液逐一点样于所述纳米膜的质检点，所述纳米膜的质检点为所述纳米膜的非靶标处、非质控点处和非空白对照处，每孔内质检点不少于2个，20nl/点；步骤4)将步骤3)点样后的所述纳米膜装入配套夹具，置于工业相机镜头下，调整镜头焦距至样品点清晰呈现且边缘明确，用工业相机逐孔拍照，用软件对各质检点进行直径测定并导出；步骤5)分析所述纳米膜上各质检点的直径数据，计算所述纳米膜上质检点直径的总体标准差、中位数和极差，总体标准差≤5％、中位数460μm～480μm、极差≤30μm为质检合格的纳米膜。2.根据权利要求1所述的微阵列芯片规模化生产的质检方法，其中，步骤1)中使纳米膜充分平衡的所述时间为20～28小时，优选24小时。3.根据权利要求1所述的微阵列芯片规模化生产的质检方法，其中，所述步骤2)中所述点样液为5％m/v甘油溶液、5％m/v山梨醇溶液、0.05％v/v曲拉通溶液、二甲基亚砜(dmso)溶液、pbs(ph6.8)溶液依次按体积比10∶15∶0.1∶50∶100混匀。4.根据权利要求1所述的微阵列芯片规模化生产的质检方法，其中，所述步骤4)所述配套夹具包括盖板和底板，所述盖板设置有多个检测窗，所述底板在与所述检测窗的相应位置设置有镂空孔，所述盖板可压紧固定在所述底板上。5.一种微阵列芯片规模化生产的制备方法，所述制备方法包括：步骤(1)将权利要求1～4中质检合格的所述纳米膜置于容器中，加入15ml活化液进行表面活化，在0.5小时后用纯化水将所述活化液冲洗干净后，用洁净空气吹干所述纳米膜的表面；步骤(2)将步骤(1)进行活化完毕的所述纳米膜置于点样仪内，按设定的程序将靶标用点样液稀释后作为靶标点点样液、羊抗鼠多抗或羊抗鼠二抗用点样液稀释后作为质控点点样液、空白对照点点样液分别点样于所述纳米膜，点样体积为20nl；步骤(3)将步骤(2)点样后的所述纳米膜装入所述配套夹具，置于温度21℃～25℃、湿度＜25％的条件下干燥6小时，用膜封闭液封闭后即为微阵列芯片。6.根据权利要求5所述微阵列芯片规模化生产的制备方法，其中，所述步骤(1)中所述活化液为含5％m/v 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐edc、2.5％m/v n-羟基琥珀酰亚胺nhs的溶液。7.根据权利要求5所述微阵列芯片规模化生产的制备方法，其中，所述步骤(3)中所述膜封闭液为含1％w/v bsa、0.1％～0.5％v/v甘油、0.1％v/v tween-20的pbs溶液。8.根据权利要求5所述微阵列芯片规模化生产的制备方法，其中，所述步骤(2)的所述靶标为动物疫病病毒抗原或其蛋白或食品安全小分子抗原。9.根据权利要求5所述微阵列芯片规模化生产的制备方法，其中，所述步骤(2)所述靶标包括猪伪狂犬病病毒gd蛋白或ge蛋白、猪瘟病毒e2蛋白、猪口蹄疫病毒抗原、猪轮状病毒抗原、霉菌毒素抗原、禽用抗生素抗原。
10.根据权利要求5所述微阵列芯片规模化生产的制备方法，其中，当微阵列芯片为猪伪狂犬病病毒gd、ge蛋白抗体二联检测芯片时，所述步骤(2)的所述靶标为猪伪狂犬病病毒gd蛋白、ge蛋白；当微阵列芯片为猪伪狂犬病病毒gd、ge蛋白、猪瘟病毒e2蛋白抗体三联检测芯片时，所述步骤(2)的所述靶标为猪伪狂犬病病毒gd蛋白、ge蛋白及猪瘟病毒e2蛋白；当微阵列芯片为o型、a型口蹄疫病毒抗体检测芯片时，所述步骤(2)的所述靶标为o型口蹄疫病毒抗原、a型口蹄疫病毒抗原；当微阵列芯片为真菌毒素四联检芯片时，所述步骤(2)的所述靶标为伏马毒素抗原、黄曲霉毒素b1抗原、呕吐毒素抗原、玉米赤霉烯酮抗原。

技术总结

本发明涉及微阵列芯片规模化生产的质检方法，包括：步骤1)将纳米膜置于洁净环境下，湿度＜20％、温度23℃～25℃条件下一段时间使纳米膜充分平衡；步骤2)配制点样液，现配现用；步骤3)将步骤1)充分平衡后的所述纳米膜置于点样仪内，用所述步骤2)所述点样液逐一点样于所述纳米膜的质检点，每孔内质检点不少于2个，20nl/点；步骤4)将步骤3)点样后的纳米膜装入配套夹具，置于工业相机镜头下，用工业相机逐孔拍照，用软件对各质检点进行直径测定并导出；步骤5)分析所述纳米膜上各质检点的直径数据，计算所述纳米膜上质检点直径的总体标准差、中位数和极差，总体标准差≤5％、中位数460μm～480μm、极差≤30μm为质检合格的纳米膜。膜。膜。