聚乙烯吡咯烷酮
该试验以蝴蝶兰原优良品种满天红花梗为外植体,对休眠芽萌发诱导、叶片原球茎诱导、原球茎增殖、根诱导和组培苗的移栽等方面进行初步研究,得出以下结果:1、花梗休眠芽的诱导在夏季、秋季、春季三个季节选取含休眠芽的花梗节段进行培养,对污染率、休眠芽萌发诱导率和芽生长状况进行了比较.试验表明秋季选取的花梗外植体灭菌效果最好,休眠芽萌发诱导率最高.MS+BA 5.0培养基较适合休眠芽的诱导.2、无菌苗叶片的原球茎诱导该试验以无菌苗叶片为外植体诱导原球茎产生,结果表明,BA浓度5.0mg·L-1最适合叶片原球茎诱导,添加15％(V/V)椰乳(CW)能提高原球茎的诱导率,并有利于原球茎的生长.MS+BA 5.0+CW 15%培养基较适合诱导叶片产生原球茎,诱导率最高达到38%.3、原球茎的增殖在MS培养基中添加一定浓度的BA和果汁能提高原球茎的增殖率.另外,添加聚乙烯吡咯烷酮(PVP)100~200mg·L<'-1>能有效控制培养基的酚污染、提高原球茎的增殖率.MS+BA 5.0+CW 15%培养基较适合原球茎的增殖.4、根的诱导在1/2MS培养基中附加一定浓度NAA(0.1~0.5 mg·L<'-1>)和多效唑MET(0.1~0.5 mg·L<'-1>)与BA配合,能诱导小苗生根.用多效唑诱导生根,幼苗矮壮,叶片较绿,有利提高幼苗的移栽成活率.添加0.3g·L<'-1>活性炭(AC)能大大提高生根苗的平均根数和平均根长.对根诱导较适合的培养基是:1/2MS+BA 2.0 +NAA 0.1+AC或1/2MS+BA 2.0+MET 0.3.5、组培苗移栽基质透气性及水分对组培苗成活率影响较大.基质水分多,基质透气性不好,易造成组培苗死亡蝴蝶兰原优良品种满天红花梗为外植体,对休眠芽萌发诱导、叶片原球茎诱导、原球茎增殖、根诱导和组培苗的移栽等方面进行初步研究,得出以下结果:1、花梗休眠芽的诱导在夏季、秋季、春季三个季节选取含休眠芽的花梗节段进行培养,对污染率、休眠芽萌发诱导率和芽生长状况进行了比较.试验表明秋季选取的花梗外植体灭菌效果最好,休眠芽萌发诱导率最高.MS+BA 5.0培养基较适合休眠芽的诱导.2、无菌苗叶片的原球茎诱导该试验以无菌苗叶片为外植体诱导原球茎产生,结果表明,BA浓度5.0mg·L-1钻井泥浆泵最适合叶片原球茎诱导,添加15％(V/V)椰乳(CW)能提高原球茎的诱导率,并有利于原球茎的生长.MS+BA 5.0+CW 15%培养基较适合诱导叶片产生原球茎,诱导率最高达到38%.3、原球茎的增殖在MS培养基中添加一定浓度的BA和果汁能提高原球茎的增殖率.另外,添加聚乙烯吡咯烷酮(PVP)100~200mg·L<'-1>能有效控制培养基的酚污染、提高原球茎的增殖率.MS+BA 5.0+CW 15%培养基较适合原球茎的增殖.4、根的诱导在1/2MS培养基中附加一定浓度NAA(0.1~0.5 mg·L<'-1>)和多效唑MET(0.1~0.5 mg·L<'-1>)与BA配合,能诱导小苗生根.用多效唑诱导生根,幼苗矮壮,叶片较绿,有利提高幼苗的移栽成活率.添加0.3g·L<'-1>活性炭(AC)能大大提高生根苗的平均根数和平均根长.对根
诱导较适合的培养基是:1/2MS+BA 2.0+NAA 0.1+AC或1/2MS+BA 2.0+MET 0.3.5、组培苗移栽基质透气性及水分对组培苗成活率影响较大.基质水分多,基质透气性不好,易造成组培苗死亡蝴蝶兰原优良品种满天红花梗为外植体,对休眠芽萌发诱导、叶片原球茎诱导、原球茎增殖、根诱导和组培苗的移栽等方面进行初步研究,得出以下结果:1、花梗休眠芽的诱导在夏季、秋季、春季三个季节选取含休眠芽的花梗节段进行培养,透明鞋盒对污染率、休眠芽萌发诱导率和芽生长状况进行了比较.试验表明秋季选取的花梗外植体灭菌效果最好,休眠芽萌发诱导率最高.MS+BA 5.0培养基较适合休眠芽的诱导.2、无菌苗叶片的原球茎诱导该试验以无菌苗叶片为外植体诱导原球茎产生,结果表明,BA浓度5.0mg·L-1最适合叶片原球茎诱导,添加15％(V/V)椰乳(CW)能提高原球茎的诱导率,并有利于原球茎的生长.MS+BA 5.0+CW 15%培养基较适合诱导叶片产生原球茎,诱导率最高达到38%.3、原球茎的增殖在MS培养基中添加一定浓度的BA和果汁能提高原球茎的增殖率.另外,添加聚乙烯吡咯烷酮(PVP)100~200mg·L<'-1>能有效控制培养基的酚污染、提高原球茎的增殖率.MS+BA 5.0+CW 15%培养基较适合原球茎的增殖.4、根的诱导在1/2MS培养基中附加一定浓度NAA(0.1~0.5 mg·L<'-1>)和多效唑MET(0.1~0.5 mg·L<'-1>)与BA配合,能诱导小苗生根.用多效唑诱导生根,幼苗矮壮,叶片较绿,有利提高幼苗的移栽成活率.添加0.3g·L<'-1>活性炭(A
C)能大大提高生根苗的平均根数和平均根长.对根诱导较适合的培养基是:1/2MS+BA 2.0+NAA 0.1+AC或1/2MS+BA 2.0+MET 0.3.5、组培苗移栽基质透气性及水分对组培苗成活率影响较大.基质水分多,基质透气性不好,易造成组培苗死亡
pvp粉末与水溶液均较稳定，可长期保存。水溶液为胶体溶液完全经得起115度30分灭菌，灭菌前后其性质无根本性的变化。只是灭菌后溶液略显黄。
2.比较老的药剂学课本中有关于pvp的灭菌水溶液作为血浆代用品的介绍。处方工艺都有详细的说明。(pvp的灭菌水溶液在二战时期间即已作为血浆代用）。
3.我以前做的几个静脉注射剂中加入PVP，其在增溶、稳定，防止药物结晶析出方面能起到很好的效果。可惜现在不能用了。药审中心有说明：在注射剂中禁用PVP
4 防止外植体产生褐变的对策
从理论上讲,酶促褐变可以通过以下三种方法加以抑制:一是除去引起氧化的物质——氧；二是捕捉或减少聚合反应的中间产物；三是抑制有关的酶。实际操作上，下列措施是被认为行之有效的。
4.1 适当外植体的选择
取材时应注意选择褐变程度较小的品种和部位作外植体。成年植株比幼苗褐变程度厉害，夏季材料比冬季及早春和秋季材料的褐变要严重。冬季的芽不易生长，宜选用早春和秋季的材料作为外植体。王异星[5]用荔枝无菌苗不同组织的诱导试验表明，茎最容易诱导出愈伤组织，培养2周后长出浅黄的愈伤组织；叶大部分不能产生愈伤组织或诱导出的愈伤组织中度褐变；而根极大部分不产生愈伤组织，诱导出的愈伤组织全部褐变。
4.2 对外植体的处理
通过对较易褐变的外植体材料的预处理能减轻醌类物质的毒害作用。处理方法如下：外植体经流水冲洗后，在2-5℃的低温下处理12-24小时，再用或70%酒精消毒，然后接种于只含有蔗糖的琼脂培养基中培养5-7天，使组织中的酚类物质部分渗入培养基中。取出外植体用0.1%漂白粉溶液浸泡10分钟，再接种到合适的培养基中。若仍有酚类物质渗出，3-5天后再转移培养基2-3次，当外植体的切口愈合后，酚类物质减少，这样可使外植体褐变减轻或完全被抑制。何琼英等[6]4g手机电子围栏用抗坏血酸预处理香蕉吸芽外植体，能减轻外植体褐变，从而提高芽丛诱导率。
磨头
4.3 适宜的培养基
培养基的成分与褐变程度有关，要考虑所选培养基的状态和类型。
4.3.1 适当的无机盐浓度 张妙霞等[7]在柿树组织培养防止褐变所进行的试验中，4种培养基的无机盐以改良MS(大量元素减半) 和1/2MS的效果最好，MS的效果较差，结果证明低浓度的无机盐可促进外植体的生长与分化，减轻外植体褐变的程度。徐振彪[1]在对玉米幼胚耐NaCl愈伤组织的筛选表明，随NaCl浓度升高，褐变现象加重。
4.3.2 适当和适量的激素 王异星[5]在荔枝的组织培养过程中，培养基中添加1 mg/L BA + 0.5mg/L 2,4-D时，愈伤组织较坚硬，增殖缓慢，易产生褐变。培养基中添加1mg/L BA+1mg/L 2,4-D 时，愈伤组织浅黄疏松，增殖也快。
4.3.3 培养基的硬度 在一定范围内，琼脂用量大，培养基硬度大，褐变率低[8]，这可能是培养基的硬度影响了酚类物质的扩散速度的缘故。
4.3.4 培养基中水的硬度的影响 硬度低的蒸馏水褐变率低,而使用硬度较高的自来水,褐变严重,甚至会出现褐变死亡[8]。这可能是配制培养基的水改变了培养基中无机盐的浓度,间接地影响了植物外植体的褐变。
4.3.5 培养基的pH值 在水稻体细胞培养中，pH值为4.5-5.0 时MS液体培养基可保持愈伤组织处于良好的生长状态，其表面呈黄白，而pH值为5.5-6.0时，愈伤组织严重褐变[9]。一般来说，酸性环境(pH值为4.5-5.0)不利于褐变过程的发生[10]。
4.3.6 培养条件 如温度过高或光照过强，光照会提高PPO的活性，促进多酚类物质的氧化，从而加速被培养的组织褐变。高浓度CO2也会促进褐变，其原因是环境中的CO2向细胞内扩散，细胞内CO32-增多，CO32-与细胞膜上的CO32-结合，使有效CO32-减少，导致内膜系统瓦解，酚类物质与PPO相互接触，产生褐变[11]。因此，初期培养要在黑暗或弱光下进行。
4.4 添加褐变抑制剂和吸附剂
褐变抑制剂主要包括抗氧化剂和PPO抑制剂。在培养基中加入偏二亚硫酸钠、L-半胱氨酸、抗坏血酸、柠檬酸、二硫苏糖醇等抗氧化剂都可以与氧化产物醌发生作用，使其重新还原为酚[12]。由于其作用过程均为消耗性的，在实际应用中应注意添加量，其中L-半胱氨酸和抗坏血酸均对外植体无毒副作用，在生产应用中可不受限制。在水稻细胞的培养基中，添加植酸(PA)，可防止褐变，PA分子中众多的羟基产生抗氧化作用，使生物质的含
量下降或PA与PPO分子中的Cu2 +结合，从而降低了其活力。陈学森等[13]在对植酸在银杏组织培养中应用的研究中也证实了植酸具有抑制多酚氧化酶活性的作用。
细胞分离培养 常用的吸附剂有活性炭和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。活性炭是一种吸附性较强的无机吸附剂，能吸附培养基中的有害物质，包括琼脂中的杂质、培养物在培养过程中分泌的酚、醌类物质以及蔗糖在高压消毒时产生的5-羟甲基糠醛等, 从而有利于培养物的生长。粉末状的活性炭与颗粒状的活性炭相比吸附性更强，一般在培养基中加入1-4g/L的活性炭。在使用过程中应注意，尽量用最低浓度的活性炭来对抗褐变的产生，因为活性炭的吸附作用是没有选择性的，在吸附物质的同时，也会吸附培养基中的其他成分，对外植体的诱导分化会产生一定的负面影响[14]。而聚乙烯吡咯烷酮(PVP)是酚类物质的专一性吸附剂，在生化制备中常用作酚类物质和细胞器的保护剂，可用于防止褐变[15]。
4.5 进行细胞筛选和多次转移
在组织培养过程中，经常进行细胞筛选，可以剔除易褐变的细胞。在外植体接种1-2天后应立即转移到新鲜培养基中，能减轻酚类物质对培养物的毒害作用，降低抑制作用，使外植体尽快分生，连续转移5-6次，可基本解决外植体的褐变问题。
香水白掌离体培养实验结果表明, 叶片在1 /2MS培养基中添加PVP 1 000 mg /L, 5天继代转接1次, 抗褐变效果较好; 叶柄在PVP为1 000mg /L, 琼脂浓度为7 g /L的培养基中, 5天继代转接1次, 可减少褐变的发生
适当降低培养基的无机盐浓度, 酸性环境( pH 值4. 5~ 5. 0) 不利于褐变的发生。加入赖氨酸、活性炭、抗坏血酸的培养基, 25天时有80%出现褐变并伴有死亡现象, 而加入0. 7g / L聚乙烯吡咯烷酮( PVP K - 90)的培养基褐变率为16% , 对抑制桑树组培苗的褐变有良好效果。
PVP浓度为1%，褐变率为41.67%，褐变等级为2，生长率为100%，除褐变外，愈伤组织长势很好；2）PVP浓度为2%，褐变率为33.33%，褐变等级为1奶报箱，生长率为100%，除褐变外，愈伤组织长势最好，且无褐变的试管均为绿，即使褐变试管也只是零星表现；3）PVP浓度为3%，褐变率为40%，褐变等级为2，生长率为100%，只有少量初始接种部分褐变，其余部分愈伤组织长大，呈淡墨；4）PVP浓度为4%，褐变率为58.33%，褐变等级为3，生长率为100%，除褐变外，愈伤组织长势较好；5）PVP浓度为CK，褐变率为50%，褐变等级为2，生长率为100%，愈伤组织生长明显。
在培养基中加入聚乙烯吡咯烷酮可以减轻愈伤组织的褐变情况，而且愈伤组织的长势良好。特别是加入浓度2%的和其他浓度的比较结果，褐变率更低，防褐变效果更好。但加入浓度4%时褐变率并没有降低。可以推测并不是浓度越高越好，相反，浓度增高会使褐变率升高，防褐变效果降低。
褐变问题
①初代培养时，剥取组织块最好能够在无菌水中进行；
②初代培养采用液体培养比用固体培养效果好；
③在培养基中单独或复合使用防褐变物质：芸香苷50-100毫克/升、20%硫代硫酸钠溶液5毫升/升、柠檬酸0.05-0.5%、活性炭1-4克/升、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）5-10克/升；
④从开始培养到成活的一段时间内保持摄氏温度17-20度；
⑤调整好培养基的酸碱度，以酸碱度为5.5时成活率高；
⑥6-8月份高温季节，外植体易褐变，成活率低；
⑦从新生的假球茎上取芽，不仅能够减少污染，而且成活率高。
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