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楼宵玮，李昊，夏书芹*，韩正阳，杨娟，倪伟
江南大学食品学院食品科学与技术国家重点实验室（无锡 214122）
摘要壳聚糖是一种阳离子多糖, 可与阴离子多糖结冷胶通过离子交联形成具有包埋生物活性物质的功能载体。探讨了水溶性壳聚糖替代天然壳聚糖制备结冷胶钙凝胶珠的可行性。通过测定包封率 (EE)、载量 (LC) 以及牛血清蛋白 (BSA) 的累积释放率 (RR) 等指标, 对该载体的包埋和释放性能进行了评价, 并运用扫描电子显微镜 (SEM)、荧光显微镜等手段对比了水溶性壳聚糖和天然壳聚糖制备的凝胶珠在超微结构上的差异。配方优化结果表明, 最佳的配方条件应为: 0.5 g/100 mL水溶性壳聚糖, 0.10~0.15 mol/L氯化钙, 1.00~1.50 g/100 mL结冷胶, 0.75 g/100 mL牛血清蛋白, 凝胶珠对BSA的包封率和载量分别可以达到83.05%和12.77%, 并在模拟消化液中有明显的缓释效果。
关键词水溶性壳聚糖; 结冷胶; 凝胶珠
Effect of Water Soluble Chitosan on the Encapsulation and Release
Aspects of Calcium Gellan Gum Gel Beads
Lou Xiao-wei, Li Hao, Xia Shu-qin*, Han Zheng-yang, Yang Juan, Ni Wei
State Key Laboratory of Food Science and Technology, School of Food Science and Technology, Jiangnan University (Wuxi 214122) Abstract Chitosan is a polysaccharide with positive charges, which can be designed as an embedding vector of protein functional ingredients via ionic-crosslinking with gellan gum. Discuss the possibility of water-soluble chitosan instead of natural chitosan in producing gel beads. The new vector’s property of encapsulation effi ciency (EE), loading capacity (LC), and cumulative release rate (RR) of the embedded BSA were evaluated. Comparison of the microstructure between gel beads made from water-soluble chitosan and natural chitosan were also been studied via scanning electron microscope (SEM) and optical microscope fl uorescence graph. The speculated optimizing formula would be: 0.5 g/100 mL water-soluble chitosan,
0.10~0.15 mol/L calcium chloride, 1.00~1.50 g/100 mL Gellan gum and 0.75 g/100 mL bovine serum albumin. Correspondingly,
the encapsulation effi ciency and loading capacity reached 83.05% and 12.77%, respectively. Meanwhile, the achieved gel bead exhibited the lowest release rate in the simulated gastric fl uid.
Keywords water-soluble chitosan; gellan gum; gel bead
智慧社区管理系统随着人们生活水平的提高，活性蛋白多肽类功能性成分也越来越受到人们的关注。但是，蛋白多肽易被胃蛋白酶水解而失活，很难发挥其生理功能。为了提高蛋白质的生物利用率[1]，通过离子交联法制备蛋白载体，实现其缓释、结肠靶向输送等特定的需求已成为功能性食品和药剂学研究的热点。天然多糖聚合物含量丰富、价格低廉、安全无毒[2]，具有良好的生物相容性和凝胶成膜性，其在结肠菌酶作用下可完全降解，因此被广泛用做生物降解型结肠靶向输送系统的载体材料。
结冷胶（Gellan gum）是一种阴离子多糖，具有凝胶能力强、耐酸耐热、稳定性好的特点，是具有纤维性状和黏弹特性的多糖聚合体。同低甲氧基果胶等大多数阴离子多糖一样，低酰基结冷胶的胶凝过程需要钙、镁等金属阳离子的存在。目前，已有结冷胶钙体系在缓控释方面应用于糠酸莫米松、头孢氨苄、格列甲嗪、甲硝唑苯甲酸、胰岛素、大米多肽和大豆多肽等药物或生物活性物质的报道，但其普遍存在包封率低、模拟胃液中突释率高的不足[3]。
壳聚糖（Chitosan）是由甲壳素经脱乙酰化反应而得到的一种高分子聚合物，与葡萄糖胺聚糖结构类似，是自然界中唯一的阳离子多糖。由于其具有很多独特的生物活性，如免疫、降胆甾醇、抗菌等[4]，
现已广泛应用于药物释放中[5]。质子化的壳聚糖可以与阴离子多糖结冷胶通过静电相互作用形成复配体，从而加强单一结冷胶钙凝胶珠体系的强度。
课题组[3]已经针对结冷胶钙单一体系存在的包封率低、模拟胃液中突释率高的问题，通过制备壳聚糖-结冷胶钙的交联复配体，摸索出了壳聚糖-结冷胶-果胶钙复配体的最佳组成及pH、包埋物含量对复配体的影响，制出了高载量和包封率、低胃中突释率的凝胶珠复配体。
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但是，天然壳聚糖不能直接溶解于水中，需要通过添加醋酸等来提供酸性环境，不仅可能对包埋的活性物质造成破坏，还给实际工业生产增加了工作量，造成不必要的成本负担，在很大程度上限制了它的推广应用[6]。水溶性壳聚糖是对壳聚糖进行改性处理的产物，主要通过控制脱乙酰化反应，引入亲水基团和壳聚糖适当解聚成小分子这三种方法来实现[7]。
因此，继续研究不需要酸性环境溶解的水溶性壳聚糖作为交联溶液制备凝胶珠复配体的可行性，旨在为工业化应用提供较少环境污染、有效保护活性蛋白多肽类包埋物的新型靶向输送载体。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
低酰基结冷胶（DE，30%）：美国斯比凯可公司；牛血清白蛋白（BSA）、无水氯化钙、甲醇（AR）：国药集团化学试剂有限公司；食品级非水溶性壳聚糖（相对分子质量约为100 000，脱乙酰度93.4%）；食品级水溶性壳聚糖（相对分子质量＜10 000，脱乙酰度＞90%，改性方法为小分子解聚）：青岛金湖甲壳制品；异硫氰酸荧光素（FITC）：美国Amresco；其他试剂均为分析纯。
UV-1600型紫外可见分光光度计：上海美普达仪器有限公司；DELTA 320型pH计：上海摩速科学器材有限公司；BZG-6020D 型真空干燥机：上海三星实验仪器有限公司；DX51/BX52型光学显微镜：日本奥林巴斯公司；S-4800型扫描电子显微镜（SEM）：日本日立公司；F-7000荧光分光光度计：日本日立公司。1.2 试验方法
1.2.1 凝胶珠的制备
表1 配方参数
试验号A壳聚糖浓度/g・(100 mL)-1
B氯化钙浓度/mol・L -1C结冷胶质量浓度/g・(100 mL)-1D壳聚糖种类
A10.000.10 1.50水溶性A20.500.10 1.50水溶性A30.750.10 1.50水溶性B10.500.05 1.50水溶性B20.500.10 1.50水溶性B30.500.15 1.50水溶性C10.500.150.75水溶性C20.500.15 1.00水溶性C30.500.15 1.50水溶性D10.500.15 1.50水溶性D2
0.50
0.15
1.50
非水溶性
将结冷胶、牛血清蛋白分别溶于8 mL和2 mL的40 ℃去离子水中，边搅拌结冷胶边加入牛血清蛋白，用醋酸调节pH至5.5。移取体积分数1%醋酸5 mL溶解天
然壳聚糖，另加45 mL去离子水稀释，或用50 mL去离子水直接溶解水溶性壳聚糖，加入无水氯化钙（具体配方参数见表1），不断搅拌，用醋酸调节pH至3.5，配制成氯化钙-（水溶性）壳聚糖交联溶液。缓慢搅拌并采用注射器（1.0 mL，7#针头）将结冷胶和牛血清蛋白的混合溶液滴加到氯化钙-（水溶性）壳聚糖交联溶液中，针头离液面高度为8 cm左右，搅拌速度80 r/min，滴速大约1滴/s，交联时间为10 min。交联完成后，用筛网过滤凝胶珠，去离子水清洗三次。使用真空干燥（37 ℃、真空度0.
1 MPa）24 h，即得（水溶性）壳聚糖-结冷胶钙凝胶珠。
1.2.2 凝胶珠的包封率及其载量的测定
将交联完成后的氯化钙-（水溶性）壳聚糖溶液与凝胶珠洗涤液合并，量取体积。取1.0 mL水溶性壳聚糖-氯化钙交联溶液和凝胶珠洗涤液的混合溶液，采用考马斯亮兰法测定游离蛋白含量。称量烘干后的（水溶性）壳聚糖-结冷胶钙凝胶珠干重，计算出实际包封率（EE）和载量（LC，mg芯材/100 mg凝胶珠）。包封率和载量计算如式（1）和式（2）：
EE=（W a -W b ）/W a ×100% （1）LC=（W a -W b ）/W ×100% （2）式中：W a -BSA初始量，mg；W b -交联溶液及洗涤液中游离BSA含量，mg；W -凝胶珠干重，mg。1.2.3 凝胶珠表征观察
采用普通光学显微镜在40×下观察干态和湿态凝胶珠的表面形态。
采用扫描电子显微镜（SEM）分别在100×和300×下对真空干燥后载有牛血清蛋白的（水溶性）壳聚糖-结冷胶钙凝胶珠的整体形态结构和剖面形态进行观察。观察前，先对凝胶珠切剖面，再在真空下喷金，加速电压设置为10.0 kV。
工地降尘采用先前报道的方法[8-9]用FITC荧光剂标记壳聚糖，按照1.2.1的方法制备凝胶珠，最后采用荧光显微
镜在40×下观察凝胶珠的表面形态和切面形态，以观察壳聚糖在凝胶珠表面的交联情况。1.2.4 凝胶珠的体外释放
精密称取0.1 g凝胶干珠于100 mL具塞锥形瓶中，加入释放介质50 mL，在恒温37 ℃± 0.5 ℃的磁力搅拌器上，进行模拟人体胃肠道环境的体外释放。定时取样，用考马斯亮蓝法测定不同时刻BSA释放量。释放介质添加顺序是：（1）pH 1.2（HCl，0.1 mol/L）无酶模拟胃液中2 h；（2）pH 6.8（KH 2PO 4/NaOH，0.05 mol/L）的无酶模拟小肠液中2 h；（3）pH 7.4（KH 2PO 4/NaOH，0.05 mol/L）的模拟结肠液中1 h。凝胶珠累积释放率（RR）计算如式（3）：
W ×LC
RR =C n ×V +i =0
n -1
C n-1×V i
×100% （3）
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式中：C n -第n 次取样时释放介质中BSA质量浓度，mg/mL；V -释放介质体积，mL；V i -第i 次取样前取样的体积，mL。
2 结果与讨论
2.1 壳聚糖种类对凝胶珠包埋及释放特性的影响2.1.1 制备和释放情况比较
水溶性壳聚糖是对壳聚糖进行各种化学改性后所得，试验采用的水溶性壳聚糖脱乙酰度＞90%，改性方法为小分子解聚，并未引入其他基团或影响到氨基，其分子量约为天然壳聚糖的1/10，因此能溶于水。表2和图1分别描述了采用不同壳聚糖种类的凝胶珠对包封率、载量、累积释放率的影响。
由表2可知，基于水溶性壳聚糖制得的凝胶珠，其包封率和载量与天然壳聚糖制得的凝胶珠并无太大差异。图1显示，水溶性壳聚糖与天然壳聚糖包埋的BSA在模拟胃液和模拟小肠液中的释放率相差不大，水溶性壳聚糖的释放率相对小一些，可能的原因是水溶性壳聚糖分子量更小，在结冷胶钙凝胶珠表面的分布更均匀，与结冷胶上的羧基复位配合更紧密，降低了凝胶珠的通透性。结果表明，水溶性壳聚糖代替天然壳聚糖制备复配凝胶珠的方法是可行的，且新型凝胶珠的性能与原凝胶珠相似。
表2 壳聚糖种类对凝胶珠的包封率和载量的影响
试验号壳聚糖种类包封率±SD/%载量±SD/mg BSA・(100 mg)-1凝胶珠
D1水溶性壳聚糖77.63±1.1621.51±4.18D2
天然壳聚糖
83.72±8.53
21.59±2.43
图1 壳聚糖种类对凝胶珠累计释放率的影响2.1.2 凝胶珠表面和超微结构比较
肉眼观察不同配方的湿态凝胶珠，其颗粒直径为2.0~3.0 mm，表面光滑，呈透明或半透明状态。干态凝胶珠直径为1 mm左右，表面有皱缩，呈乳白。光学显微镜观察发现，表面覆盖有壳聚糖的凝胶珠在表面细微结构上与纯结冷胶钙凝胶珠有所不同（图2）。交联有壳聚糖的凝胶珠表面更加圆润细腻，没
有较大的沟壑。
（a）结冷胶钙凝胶珠（40×）
（b）水溶性壳聚糖-结冷胶钙
凝胶珠（40×）
图2 湿态凝胶珠的光镜照片
扫描电子显微镜观察结果如图3所示，干燥后，载有BSA的水溶性壳聚糖和天然壳聚糖制备出的凝胶珠都发生明显体积变化，表面粗糙并产生褶皱和裂纹，整体形态呈椭球形。但是前者表面更光滑，沟壑较后者浅，可知其表面的水溶性壳聚糖-结冷胶聚电解质复合膜覆盖更全面，阻碍蛋白质在模拟消化液中的释放和扩散的能力更强，可作为前者释放率比后者
稍低的解释之一。
（a）载有BSA的水溶性壳聚糖-结冷胶钙凝胶珠的局部形态（300×）（b）载有BSA的天然壳聚糖-结冷胶钙凝胶珠的局部形态（300×）图3 干燥凝胶珠的SEM照片
荧光显微镜观察标记有FITC荧光剂的壳聚糖在凝胶珠表面的分布情况如图4所示，绿荧光显示壳聚糖在结冷胶表面有较均匀的交联，半球切片显示壳聚糖在结冷胶外层有均匀的覆盖，有明显的核壳结构，说明两者之间有一定的交联。有趣的是，水溶性壳聚糖的外壳与天然壳聚糖-结冷胶钙凝胶珠（图
高铬铸铁中未给出）相比更薄，可能是水溶性壳聚糖的分子量较小，链长较短所致。
（a）表面形态 （b）切面形态
图4 FITC标记水溶性壳聚糖的结冷胶钙湿态凝胶珠的荧光光学显微镜照片（40×）2.2 壳聚糖-结冷胶钙凝胶珠的配方优化2.2.1 水溶性壳聚糖浓度的影响
水溶性壳聚糖可以与结冷胶产生静电作用，生成
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聚合电解质络合物[10]。未交联壳聚糖的结冷胶钙凝胶珠表面有许多深刻的褶皱，而水溶性壳聚糖-结冷胶钙凝胶珠表面仅有较浅网状褶皱，荧光显微镜检验照片也显示凝胶珠表面交联有水溶性壳聚糖，表明水溶性壳聚糖可起到固化结冷胶钙凝胶珠并减少其通透性的作用。
由表3可以看出，水溶性壳聚糖的加入使BSA的包封率有所上升。载量的降低说明壳聚糖的加入增加了凝胶珠的重量，使单位质量凝胶珠加载的BSA量减少。当壳聚糖质量浓度为0.50 g/100 mL时，BSA的包封率最高，为83.05%。当水溶性壳聚糖浓度较低时，其可在低酸性环境中质子化，并在结冷胶钙凝胶珠外层均匀分布，其渗透到结冷胶钙分子网孔中的分子链段上的氨基与结冷胶中剩余的羧基配位复合，有效降低了凝胶珠孔隙率和通透性[11]。
表3 水溶性壳聚糖浓度对凝胶珠包封率和载量的影响
试验号壳聚糖质量浓度/g・100 mL -1包封率±SD/%
载量±SD/mg BSA・
(100 mg)-1凝胶珠
A10.0080.01±6.8520.05±7.85A20.5083.05±5.9512.77±6.90A3
0.75
82.09±5.05
17.40±5.95
图5呈现了壳聚糖浓度对BSA的模拟消化道累积释放率的影响，一定比例水溶性壳聚糖的添加可以抑制凝胶珠中BSA的突释现象。当壳聚糖质量浓度为0.50 g/100 mL时，凝胶珠在模拟胃液中孵育1 h的释放率比未添加水溶性壳聚糖低近25%。然而，当浓度过大时，壳聚糖聚集分子可能聚集缠绕，无法在结冷胶钙外层均匀分散，从而对凝胶珠通透性的改善效果
不佳。
图5 壳聚糖浓度对凝胶珠的累积释放率的影响2.2.2 氯化钙浓度的影响
钙离子是使结冷胶凝集的关键物质，其可以连接在两个结冷胶分子的羧基之间，屏蔽结冷胶体系的静电排斥，促进分子间交联。另一方面，壳聚糖与钙离子同为阳离子，对结冷胶的羧基会产生相互竞争，钙离子如过量，显然占据了壳聚糖与结冷胶羧基交联的机会，因此合理的钙离子浓度对于形成良好的复合体
是至关重要的。
由表4可知，随着钙离子浓度的增高，包封率和载量不断降低。当氯化钙浓度为0.05 mol/L的时候，凝胶珠具有最高的包封率。试验观察发现，随着Ca 2+浓度的提高，湿态凝胶珠的颜逐渐由透明变成半透明状态，干燥后的凝胶珠的形态由椭球形逐渐趋向圆整。当不存在Ca 2+时，BSA-结冷胶体系难以在壳聚糖溶液中形成凝胶珠，且干燥后无法形成微球状。随着钙离子浓度增大，凝胶珠的机械强度也随之增大，但是钙离子浓度过大则会导致凝胶珠机械强度迅速下降，其原因可能是BSA-结冷胶体系滴入高浓度氯化钙溶液中致其表面瞬间形成致密凝胶[12]，阻止了氯化钙的渗透。
表4 氯化钙浓度对凝胶珠的包封率和载量的影响
试验号氯化钙浓度/mol・L -1
包封率±SD/%载量±SD/mg BSA・(100 mg)-1凝胶珠
B10.0583.69±4.8624.98±3.09B20.1078.47±9.0122.97±0.22B3
0.15
77.59±9.47
16.68±2.43
从图6中可以看出，随钙离子浓度升高，BSA在模拟胃液中的突释率不断降低，当氯化钙浓度为0.15 mol/L时，凝胶珠中BSA在胃液中的释放率最低。在结冷胶体系中，低浓度的钙离子将促进形成并稳定三维网状体系；然而，过量的钙离子易阻碍结冷胶双螺旋结构的聚集，不利于凝胶珠表面形成复合膜，从而增大了凝胶珠的通透性[3]。虽然试验中0.05 mol/L钙离子凝胶珠的载量最高，但是其在模拟胃液中突释率较高，而钙离子浓度为0.10 mol/L的释放率约为44%，因
此选择0.10 mol/L。
图6 氯化钙浓度对凝胶珠的累积释放率的影响2.2.3 结冷胶浓度的影响
结冷胶溶于水后，分子间会形成双股螺旋结构并通过氢键作用稳固，双螺旋结构进一步聚集成三维网状结构[13]。结冷胶的黏度随浓度的增加呈上升趋势，浓度越高，结冷胶生成的三维网状结构越致密，所形成的凝胶珠会将BSA包裹得越封闭，可以有效提高包封率和载量；但是，结冷胶浓度过高将延长芯材扩散
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途径，从而减弱BSA从凝胶珠中的释放，延长蛋白释放时间。结冷胶的凝胶化有两个步骤即链排序和链交联[14]，双螺旋二聚体长链形成反平行排列，通过彼此的“羧基-Ca 2+-羧基”链桥链接形成凝胶[13, 15]。
如表5所示，质量浓度为1.00 g/100 mL -1的结冷胶有着较高的包封率和载量，其最高水平为84.95%和23.48 mg BSA/100 mg凝胶珠。图8显示，BSA的累积释放率随结冷胶浓度上升而下降。
试验发现，即使不存在钙离子，结冷胶在浓度1.50%以上在常温下易形成热可逆性的弱凝胶，难以与BSA混匀吸入针管，而且其黏度过大容易堵塞针头。在钙离子存在的体系中，结冷胶浓度低至0.05%仍可形成凝胶[16]，但为了获得的凝胶珠具有良好的形态和机械强度，试验中的结冷胶浓度远大于其最低凝胶浓度。当结冷胶质量浓度为1.00 g/100 mL -1时，凝胶珠有最高的包封率和载量，同时为了保证胃液中释放率较低，最优结冷胶质量浓度选择1.00 g/100 mL -1。表5 结冷胶浓度对凝胶珠的包封率和载量的影响
试验号结冷胶质量浓度/g・100 mL -1
包封率±SD/%载量±SD/mg BSA・
(100 mg)-1凝胶珠
C10.7580.97±6.4424.17±2.06C2 1.0084.95±1.9723.48±0.87C3
1.50
77.63±1.16
21.51±4.18
图7 结冷胶浓度对凝胶珠的累积释放率的影响焊接三通
3 结论
led点阵书写显示屏基于先前报道的天然壳聚糖-结冷胶钙凝胶珠的研究，针对天然壳聚糖需要大量醋酸溶解的不足，提出了使用水溶性壳聚糖替代天然壳聚糖制备凝胶珠的方案。试验采用离子移变交联和聚电解质络合相结合的方法，以BSA模拟蛋白类功能成分，以包封率、载量、累积释放率为主要指标，比较了水溶性壳聚糖与天然壳聚糖制备凝胶珠的药物包埋特性及在人体模拟消化系统中的释放特性，其中水溶性壳聚糖凝胶珠的包封率与天然壳聚糖凝胶珠近似，且其在模拟胃液中BSA突释率下降了4.41%，证实了水
溶性壳聚糖-结冷胶钙凝胶珠代替天然壳聚糖-结冷胶钙凝胶珠的可行性。通过试验推测，新凝胶体系的最佳配方应该为：
0.5 g/100 mL水溶性壳聚糖，0.10~0.15 mol/L氯化钙，
1.00~1.50 g/100 mL结冷胶溶液，0.75 g/100 mL牛血清蛋白。水溶性壳聚糖有望代替天然壳聚糖作为多糖载体输送蛋白功能因子的新材料。
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