第２４期 收稿日期：２０２０－０６－２４
基金项目：营口理工学院青年项目（项目编号：ＱＮＬ２０１８０８）作者简介：姜莉莉（１９８３—），女，辽宁营口人，副教授，研究方向：生物基化学品的制备与分离。
姜莉莉，朱宝伟，刘凤翊，李昌丽，邢九霄，李铭基
（营口理工学院化环学院，辽宁营口 １１５０００）
摘要：细菌纤维素是由微生物产生的细胞外多糖类聚合物的统称，细菌纤维素具有很多优越的性质。利用拟青霉菌制备真菌膜，测试真 菌膜含水量，运用扫描电子显微镜对真菌膜的微观形貌和纤维结构进行观察，使用热重分析对真菌膜样品的热学性能进行分析，并通过实验确定制备该真菌膜的最佳条件。实验结果表明：该拟青霉菌真菌膜的含水量为７２．５４％，生产真菌膜的最佳氮源为硫酸铵，最佳碳源为蔗糖，最佳温度为３７℃，最佳ｐＨ值为２，最佳培养时间为８ｄ。本研究为拟青霉菌真菌膜的制备提供参考。关键词：细菌纤维素；拟青霉菌；真菌膜；最佳培养条件中图分类号：ＴＱ９２０．６ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００８－０２１Ｘ（２０２０）２４－００２７－０３ ＳｔｕｄｙｏｎｔｈｅＰｒｅｐａｒａｔｉｏｎａｎｄＦｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ
ＣｏｎｄｉｔｉｏｎｓｏｆｔｈｅＦｕｎｇａｌＭｅｍｂｒａｎｅｆｒｏｍＰａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ
ＪｉａｎｇＬｉｌｉ，ＺｈｕＢａｏｗｅｉ，ＬｉｕＦｅｎｇｙｉ，ＬｉＣｈａｎｇｌｉ，Ｘｉｎｇｊｉｕｘｉａｏ，ＬｉＭｉｎｇｊｉ
（ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＣｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ＹｉｎｇｋｏｕＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｙｉｎｇｋｏｕ １１５０００，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｂａｃｔｅｒｉａｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅｉｓｔｈｅｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｐｏｌｙｍｅｒｓｐｒｏｄｕｃｅｄｂｙｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ．Ｂａｃｔｅｒｉａｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅｈａｓ
ｍａｎｙｓｕｐｅｒｉｏｒｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ．Ｉｎｔｈｉｓｐａｐｅｒ
，Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓｗａｓｕｓｅｄｔｏｐｒｅｐａｒｅｆｕｎｇａｌｍｅｍｂｒａｎｅ，ｔｈｅｗａｔｅｒｃｏｎｔｅｎｔｏｆｆｕｎｇａｌｍｅｍｂｒａｎｅｗａｓｔｅｓｔｅｄ，ｔｈｅｍｉｃｒｏｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙａｎｄｆｉｂｅｒｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆｆｕｎｇａｌｍｅｍｂ
ｒａｎｅｗｅｒｅｏｂｓｅｒｖｅｄｂｙｓｃａｎｎｉｎｇｅｌｅｃｔｒｏｎｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ，ｔｈｅ
ｔｈｅｒｍａｌｐｒｏｐｅｒｔｙｏｆｆｕｎｇａｌｍｅｍｂｒａｎｅｗａｓａｎａｌｙｚｅｄｗｉｔｈｔｈｅｒｍｏｇｒａｖｉｍｅｔｒｙ
，ａｎｄｔｈｅｂｅｓｔｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｆｏｒｔｈｅｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｏｆｆｕｎｇａｌｍｅｍｂｒａｎｅｗｅｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ．Ｔｈｅｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｒｅｓｕｌｔｓｗｅｒｅａｓｆｏｌｌｏｗｔ：ｔｈｅｗａｔｅｒｃｏｎｔｅｎｔｏｆｔｈｅｆｕｎｇａｌｍｅｍｂｒａｎｅｗａｓ７２．５４％，ｔｈｅ
ｂｅｓｔｎｉｔｒｏｇｅｎｓｏｕｒｃｅｆｏｒｔｈｅｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｆｕｎｇａｌｍｅｍｂｒａｎｅｗａｓａｍｍｏｎｉｕｍｓｕｌｆａｔｅ
，ｔｈｅｂｅｓｔｃａｒｂｏｎｓｏｕｒｃｅｗａｓｓｕｃｒｏｓｅ，ｔｈｅｂｅｓｔｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｗａｓ３７℃，ｔｈｅｂｅｓｔｐＨｗａｓ２，ｔｈｅｂｅｓｔｃｕｌｔｕｒｅｔｉｍｅｗａｓ８ｄａｙｓ．Ｔｈｉｓｓｔｕｄｙｐｒｏｖｉｄｅｄａｒｅｆｅｒｅｎｃｅｆｏｒｔｈｅｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｏｆｆｕｎｇａｌｍｅｍｂｒａｎｅ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｂａｃｔｅｒｉａｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅ；Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ；ｆｕｎｇａｌｍｅｍｂｒａｎｅ；ｏｐｔｉｍｕ
ｍｃｕｌｔｕｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ 地球上含量多的天然高分子化合物是纤维素，植物可以利用葡萄糖在某些酶的作用下合成纤维素，而自然界中某些微生物如细菌、真菌等也可以利用葡萄糖合成纤维素，这种由微生
物（主要为细菌）产生的纤维素就是细菌纤维素［１］
。细菌纤维素膜具有非常高的纯净度、超高的体积模量、非常好的生物兼容性、高透明度、在无干扰的自然条件下可自动分解等特点，这
是一种优秀的纳米生物材料
［２－３］
。与植物来源的纤维素相比，细菌纤维素具有优越的物理、化学、机械性能。细菌纤维素具有更高的纯净度和非常高聚合结晶度，并且细菌纤维素不会以
半纤维素、酚类聚合物等单纤维形式存在［４］
。细菌纤维素具有非常高的生物兼容性，可在无干预的自然条件下自动分解，处理方便且不会产生环境污染，现在已用于外科医用敷料、人造
皮肤、人造血管等研究［５］
，并取得了很大进展。
拟青霉属真菌（
Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）属于半知菌亚门、丝抱纲、丝抱目、丛梗抱科，在自然界中普遍存在［６］
。拟青霉菌属真菌也是一类非常重要的虫生真菌，这类虫生真菌在环境中可以侵入多种害虫体内，使害虫患病致死，从而达到生物防治的目的。拟青霉菌在冬虫夏草中已有报道，腺苷在冬虫夏草中起主要作用，具有滋补肾脏、止血化痰、提高身体免疫力等功效，拟青霉
菌可以产生腺苷［７－８］
。拟青霉菌产的真菌膜也是细菌纤维素的一种，具有细菌纤维素的优异特性，并且还具有一定的医疗保健功能，比普通细菌纤维素使用范围更广，其制备的真菌膜
具有更大的开发应用潜力［９］
。
本论文利用从富里酸溶液中筛选的拟青霉菌（ＰａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓＨＧＸ－１）制备真菌膜，通过实验确定制备该真菌膜的最佳条件，并对其含水量、微观形貌结构、热
学性能进行实验分析，以期为真菌膜的制备提供参考。
１ 材料与方法
１．１ 试剂
葡萄糖、琼脂、盐酸、氢氧化钠、硫酸铵、酵母膏、酵母浸粉、胰蛋白胨、蔗糖、葡萄糖、果糖、乳糖、七水硫酸镁、磷酸二氢钾均为分析纯。
１．２ 仪器
ＹＰ２００１Ｗ型电子天平：上海精密仪器仪表有限公司、ＢＸＭ－３０Ｒ型立式压力蒸汽灭菌器：上海博迅实业有限公司医疗设
备厂、
ＳＰＸ－２５０Ｂ－Ｚ型生化培养箱：上海博迅实业有限公司医疗设备厂、ＧＺＸ－９１４６ＭＢＥ
型鼓风干燥箱：上海仪电分析仪器有限公司、ＫＹＫＹ－ＥＭ６Ｘ００型扫描电子显微镜：北京中科科仪股份有限公司、Ｑ５００型热重分析仪：美国ＴＡ仪器公司。
１．３ 培养基与菌种
土豆培养基：土豆２００ｇ，葡萄糖２０ｇ，琼脂１８ｇ，水１０００ｍＬ
。葡萄糖：天津市瑞金特化学品有限公司、琼脂：北京奥博星生物技术有限责任公司；
拟青霉菌（ＰａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓＨＧＸ－１）：营口理工学院化学与环境工程系生物工程实验室分离筛选。
１．４ 拟青霉菌真菌膜的制备
１．４．１ 菌种活化
将将４℃冰箱保存的菌种划线于含有固体土豆培养基的培养皿上，并将培养皿倒置于恒温培养箱中，３７℃培养４８ｈ，进行菌种的活化培养。热顶结晶器
·
７２·姜莉莉，等：拟青霉菌来源真菌膜的制备及发酵条件优化研究
山 东 化 工
１．４．２ 真菌膜的制备
将活化的菌种用接种环接种在含有１００ｍＬ液体土豆培养基的三角瓶中，将三角瓶置于恒温培养箱中，３７℃静置培养５ｄ，获得真菌膜。
１．５ 真菌膜产膜量的测定
omap4460在已经产膜的液体培养基中加入８％的ＮａＯＨ溶液，并于８０℃水浴锅中水浴，处理去除膜上的培养基和菌体等成分，之后将菌膜取出并反复用去离子水冲洗至洗液为中性，并于８０℃水浴中继续处理直至膜变为无透明。
１．６ 真菌膜的形貌结构及其表征测试
（１）将获得的真菌膜用滤纸吸取表面的水分后测定其湿重，并在完全干燥后测定其干重，计算其含水量。
（２）利用ＫＹＫＹ－ＥＭ６Ｘ００扫描电子显微镜对真菌膜的微观形貌和纤维结构进行观察。
（３）采用Ｑ５００型热重分析仪对真菌膜样品的热学性能进行分析。
１．７ 真菌膜产膜量的优化
１．７．１ 不同氮源对真菌膜产量的影响实验
分别选取硫酸铵、酵母膏、酵母浸粉、胰蛋白胨四种氮源，在碳源葡萄糖，无机盐为七水硫酸镁和磷酸二氢钾，ｐＨ值为２，培养温度３７℃，培养时间５ｄ的条件下，测每种氮源下产膜干重，选出最佳氮源。
１．７．２ 不同碳源对真菌膜产量的影响实验
分别选取葡萄糖、蔗糖、果糖、乳糖四种碳源，氮源选取实验测出的最佳氮源，在无机盐为七水硫酸镁和磷酸二氢钾，ｐＨ值为２，培养温度３７℃，培养时间５ｄ的条件下，测每种碳源下产膜干重，选出最佳碳源。
１．７．３ 不同温度对真菌膜产量的影响实验
分别选取３７℃、３０℃、室温三种不同温度，选取最佳氮源，最佳碳源，在无机盐为七水硫酸镁和磷酸二氢钾，ｐＨ值为２，培养时间５ｄ的条件下，测不同温度下产膜干重，选出最佳培养温度。
１．７．４ 不同ｐＨ值对真菌膜产量的影响实验
分别选取ｐＨ值为２、７、１２三种不同培养基酸碱度，选取最佳氮源、最佳碳源、最佳培养温度，在无机盐为七水硫酸镁和磷酸二氢钾，培养时间５ｄ的条件下，测每种ｐＨ值下产膜干重，选出最佳ｐＨ值。
１．７．５ 不同培养时间对真菌膜产量的影响实验
分别选取２，３，４，５，６，７，８，９ｄ等不同培养时间，选取最佳氮源、最佳碳源、最佳培养温度、最佳ｐＨ值，在无机盐为七水硫酸镁和磷酸二氢钾的条件下，测不同培养时间下菌膜干重，选出最佳培养时间。
２ 结果与讨论
２．１ 不同氮源对真菌膜产量的影响
由表１所示，当氮源为硫酸铵时拟青霉菌真菌膜最高，此时真菌膜的干重可达０．７８０２ｇ，故拟青霉菌产膜的最佳氮源为硫酸铵。不同氮源对不同微生物产细菌纤维素的影响各不相同，在木醋杆菌中蛋白胨和酵母浸粉按照一定比例联合使用时，对其产膜量影响较大。拟青霉菌属真菌，与细菌不同，其利用无机氮源的能力更强一些，这也是其优势之一。
表１ 不同氮源对拟青霉菌产膜量的影响
氮源种类硫酸铵胰蛋白胨酵母浸粉酵母膏
菌膜干重／ｇ０．７８０２±７．２×１０－７０．４８６８±１．４６×１０－４０．３１１９±２．７１×１０－４０．２９９６±３．３８×１０－６
２．２ 不同碳源对真菌膜产量的影响
由表２所示，当碳源为蔗糖时，拟青霉菌真菌膜干重最高，可达０．３９０９ｇ，高于当碳源为葡萄糖、果糖、乳糖时拟青霉菌真菌膜的干重，所以最佳碳源为蔗糖。蔗糖对拟青霉菌真菌膜产量有较大影响，与细菌类似，蔗糖会在细胞内某些酶的作用下快速水解成果糖苷和葡萄糖苷，果糖苷被细胞用于生长代谢，葡萄糖苷参与到菌膜的合成和细胞的生长代谢过程。
表２ 不同碳源对拟青霉菌产膜量的影响
碳源种类蔗糖葡萄糖果糖乳糖
菌膜干重／ｇ０．３９０９±１．４８×１０－４０．２４２１±３．４６×１０－４０．０７２９ｇ±１．１５×１０－４０．０１５８±５．８３×１０－４
２．３ 不同温度对真菌膜产量的影响
由表３可见，当培养温度为３７℃时，拟青霉菌真菌膜干重最高，可达０．１９２３ｇ，故最佳培养温度为３７℃。温度会影响微生物活性，主要原因是温度会影响细胞膜的流动性与细胞内生物大分子的活性，从而影响细胞的生长代谢。木醋杆菌最适培养温度在３０℃左右［１０］，与木醋杆菌不同，拟青霉菌生长温度为２０～４０℃，其最适生长温度大约在３５～４０℃。
表３ 不同温度对拟青霉菌产膜量的影响点火模块
培养温度３７℃３０℃室温
菌膜干重／ｇ０．１９２３±２．６６×１０－５０．０５５６±４．０５×１０－５０．０２８６±１．０７×１０－４
２．４ 不同ｐＨ值对真菌膜产量的影响
由表４可见，当ｐＨ值为２时，拟青霉菌真菌膜干量最高，可达０．４５５９ｇ，所以本实验中最佳ｐＨ值为２。ｐＨ值对微生物生命活动的影响较大，主要是ｐＨ值会改变细胞膜的通透性，引起细胞膜结构稳定性的变化，从而影响微生物对营养成分的吸收；ｐＨ值还会影响细胞内酶的活性。不同微生物的生长ｐＨ值范围各不相同，木醋杆菌的适应ｐＨ在中性左右［１０］，而拟青霉菌与木醋杆菌模块化机组
不同，最适ｐＨ为酸性。
表４ 不同温度对拟青霉菌产膜量的影响
ｐＨ值２７１２菌膜干重／ｇ０．４５５９±５．５８×１０－３０．２５９３±９．６０×１０－３未生长菌
２．５ 不同培养时间对真菌膜产量的影响
由图１可见，当拟青霉菌培养８ｄ时，其干膜重最高，可达０．２７０３ｇ，高于其他培养时间的菌膜干重，所以最佳培养时间为８ｄ。一般随着培养时间的增加，微生物的种密度也会增加，但随着营养物质的减少，种密度到达一定限度后，菌体就会开始消亡。在此实验中，当培养时间达到９ｄ时，培养基内营养物质完全耗尽，真菌膜重量下降。
·
８
２
·ＳＨＡＮＤＯＮＧＣＨＥＭＩＣＡＬＩＮＤＵＳＴＲＹ ２０２０年第４９卷
第２４
期图１ 不同培养时间对拟青霉菌产膜量影响
２．６ 真菌膜的形态结构
将拟青霉菌接种在含有液体培养基的锥形瓶中并置于恒
温培养箱中，３７℃静置培养８ｄ，获得真菌膜，如图２所示。真菌膜直径约为７ｃｍ，表面光滑、湿润，韧性较好，其含水量可达
７２．５４％。
利用扫描电子显微镜对真菌膜的纤维结构进行观察，如图３所示。真菌膜孔状结构较为明显，孔径约６μｍ，这种结构使
得真菌膜含水量较高。
ａ．拟青霉菌真菌膜水浴处理前；ｂ．拟青霉菌真菌膜水浴处理后
图２
拟青霉菌真菌膜形态
led点阵书写显示屏ａ．不同放大倍率１０００倍；ｂ．不同放大倍率５０００倍
图３ 拟青霉菌真菌膜的纤维结构
２．７ 真菌膜的热学性能
采用热重分析仪对真菌膜样品的热学性能进行分析，取少
量干燥后的真菌膜样品在氮气保护下，测定样品在２
４℃至８００℃之间的质量变化，如图４所示。真菌膜在２４℃开始分解，主要失重温度在２６２～５０７℃范围内，细菌纤维素有类似的分解曲
线。其在前２５０℃范围内失重较慢，２５０～５００℃失重开始加快，到６００℃真菌膜质量下降缓慢，进入平稳期。实验表明该真菌膜热稳定性较强。普通细菌纤维素的失重温度主要在１８０～５００℃［１１］
t载体，
真菌膜热稳定性要优于普通细菌纤维素。图４ 真菌膜的热重分析曲线３ 结论
本文利用拟青霉菌制备真菌膜，实验制备真菌膜的最佳氮
源为硫酸铵，最佳碳源为蔗糖，最佳温度为３
７℃，最佳ｐＨ值为２，最佳培养时间为８ｄ。经测试该真菌膜含水量为７２．５４％；利用扫描电子显微镜对真菌膜的纤维结构进行观察，发现其具有孔状结构，孔径约为６μｍ；该真菌膜主要失重温度在２６２～５０７
℃范围内，热稳定性较强。
参考文献
［１］ＥＬＩＡＮＥＴ．Ｂａｃｔｅｒｉａｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅ［Ｊ］．Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒ
Ｎａｎｏｃｏｍｐｏｓｉｔｅｓ，２０１３，３８：３３９－３６６．
（下转第３２页）
·
９２·姜莉莉，等：拟青霉菌来源真菌膜的制备及发酵条件优化研究
山 东 化 工
７ ４０（ｄｄ，Ｊ
１
＝１．２Ｈｚ，Ｊ２＝７．２Ｈｚ，１Ｈ），７．２２～７．２７（ｍ，２Ｈ），
４ ０６～４．１３（ｍ，２Ｈ），３．８６（ｑ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，１Ｈ），１．４３（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，３Ｈ），１．１５（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，３Ｈ）；１３Ｃ－ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ
－ｄ
６
）δ：１７３．７４６，１６０．１７１，１５８．５３８，１４２．９７９，１４２．９２６，１３５．２５５，１３１．２２７，１３１．２００，１２９．１４４，１２９．１２５，１２９．０
０７，１２８．２１４，１２７．３０６，１２７．２１４，１２４．３４６，１２４．３２７，１１５．６０７，１１５．４５５，６０．９０５，４４．３７４，１８．８１３，１４．３７７。
１．２ 制备氟比洛芬
２５０ｍＬ三口瓶中加入氟联苯基丙酸乙酯２０．１５ｇ（７４ｍｍｏｌ），四氢呋喃１５０ｍＬ、水１５ｍＬ、氢氧化钠１１．７９ｇ（３００ｍｍｏｌ），搅拌后，加热至回流后，反应５ｈ。降至室温，析晶１２ｈ，抽滤，滤饼加入２５０ｍＬ水搅拌，使其完全溶解，维持０℃±５℃滴加盐酸至ｐＨ值＝２。滴加结束后，０℃搅拌析晶０．５ｈ。析出的固体经抽滤，干燥后，得氟比洛芬白固体１６．０５ｇ，收率８８ ７％。
ＨＲＭＳ（ｍ／ｚ）：２４３．０８３０［Ｍ＋Ｈ］＋；１Ｈ－ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，
ＤＭＳＯ－ｄ
６
）δ：１２．７５（ｓ，１Ｈ），７．４６～７．５５（ｍ，５Ｈ），７．３９（ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ），７．２６（ｓ，１Ｈ），７．２４（ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，１Ｈ），３．７９（ｑ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ），１．４２（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，３Ｈ）；１３Ｃ－ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，
ＤＭＳＯ－ｄ
６
）δ：１７５．４４７，１６０．１２９，１５８．４９６，１４３．７７３，１４３．７２７，１３５．３７３，１３１．０７８，１３１．０５５，１２９．１５６，１２９．０４１，１２９．０２６，１２８．９８８，１２８．１７９，１２７．０５８，１２６．９６６，１２４．４７２，１２４．４４９，１１５．６５３，１１５．５００，４４．７２１，１８．７６０。
２ 结果与讨论
本文系统的研究了氟比洛芬合成中，催化剂在偶联反应中
的作用，在多个廉价金属催化剂中，三价铁催化剂Ｆｅ（ａｃａｃ）
３
可以催化格氏试剂与２－溴丙酸乙酯的偶联反应，并以四甲基乙二胺为配体时效果最好。反应在低温下进行，可避免其它副反应。按照中国药典标准检测铁盐，本方法制备的氟比洛芬合格。
参考文献
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－ｂｒｏｍｏｅｓｔｅｒｓｗｉｔｈａｒｙｌｇｒｉｇｎａｒｄｒｅａｇｅｎｔｓ［Ｊ］．ＪＡｍＣｈｅｍ
Ｓｏｃ，２０１４，１３６：１７６６２－１７６６８．
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·ＳＨＡＮＤＯＮＧＣＨＥＭＩＣＡＬＩＮＤＵＳＴＲＹ ２０２０年第４９卷
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