Levan果聚糖的应用与生产研究进展
陆娟;唐俊;肖敏;屈长青
【摘 要】Levan是一类果聚糖,由大量的果糖单元以β-(2,6)果糖苷键连接构成聚糖主链并含有少量β-(2,1)果糖苷键连接的支链组成.部分微生物来源的Levan具有抗肿瘤、抗病毒、降血糖、降血脂、免疫增强等重要的生物活性,在医药和功能性食品方面具有巨大的应用潜能.微生物发酵液提取和酶法合成是目前大量获得Levan果聚糖的两种方法,其中微生物发酵液提取的Levan果聚糖产量和蔗糖转化率一般较低,且发酵液中同时存在的其他高聚物不利于Levan的规模化纯化;而利用Levan蔗糖酶以蔗糖为底物转果糖基合成的Levan果聚糖产量已经高达200 g/L、蔗糖转化率高达50%,并且Levan蔗糖酶合成Levan过程中酶的活性受到pH值、温度、螯合剂、金属离子等多种因素的影响,可以通过控制反应条件促进多糖合成反应的进行.因此,酶法合成将是工业化获得Levan果聚糖的主要方式. 【期刊名称】《生物学杂志》
【年(卷),期】2013(030)006
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【总页数】5页(P86-90)
【关键词】Levan;应用;生产;酶法合成
【作 者】陆娟;唐俊;肖敏;屈长青
【作者单位】阜阳师范学院生命科学学院,阜阳,236037;阜阳师范学院生命科学学院,阜阳,236037;山东大学,微生物技术国家重点实验室,国家糖工程技术研究中心,济南,250100;阜阳师范学院生命科学学院,阜阳,236037钻机转盘
【正文语种】中 文
【中图分类】Q539;Q93
Levan是一类主要来源于微生物的果糖高聚物，由大量β-(2，6)果糖苷键组成的聚糖主链及少量β-(2，1)果糖苷键组成的支链组成，与主要由β-(2，1)果糖苷键组成的菊粉(inulin)显著不同(图1)。来源于植物的Levan果聚糖分子量在2000－3，3000 Da范围内，而来源于微生物的Levan果聚糖分子量较高，通常为2×106～100×106Da。Levan的粘度较小，在水中具
有不溶胀、不形成凝胶、具有假塑性等特性［1］，并且Levan和甘油的混合物经热处理后可以形成柔韧而有粘性的薄膜［2］，因此它在医药和食品等方面具有非常好的工业化应用前景。本文对Levan果聚糖的功能及其应用、Levan果聚糖的生产方式以及影响Levan蔗糖酶合成Levan的因素进行了综述。
经络拍1 Levan果聚糖的功能及其应用
1.1 医药方面
研究发现，微生物来源的Levan具有一定的抗肿瘤、抗病毒、降血糖、降血脂、免疫增强等功能，具有医药领域应用的潜能。目前植物来源的Levan还未见功能研究的报道。
图1 两类果聚糖的分子结构Fig 1 Structures of fructans:(A)levan，(B)inulin
Levan具有一定的抗肿瘤活性，但受分子量和分支结构不同的影响。2004年，Yoo等从木醋杆菌(Gluconoacetobacter xylinus KCCM 41431)、果聚糖微杆菌(Microbacterium laevaniformans KCTC 9732)、水生拉恩氏菌(Rahnella aquatilis KCTC 2863)和运动发酵单胞菌(Zvmomonas mobilis KCCM 29191)四种微生物发酵液中分别提取了四种分子量不 同的Levan，分别为G-levan、M-levan、R-levan 和 Z-levan，它们都具有一定的抗肿瘤活性，体外针对八种肿瘤细胞株的实验结果显示 M-levan(Mw=710，000)和 R-levan(Mw=380，000)对 SNU-1(Stomach carcinoma，human，KCLB 00001)的抗性分别达到52.54% ～62.05%和52.15%～58.58%，M-levan对 HepG2(Hepatocellular carcinoma，human，KCLB 58065)的抗性达到 49.93% ～61.82%［3］。体内抑制 Sarcoma 180 生长实验中，M-、R-和Z-levan(Mw=570，000)的抑制率平均达到66%;G-levan(Mw=40，000)对Sarcoma 180的抑制率相对较低，为42%。同年，Yoon和Yoo等进一步研究来源于果聚糖微杆菌KCTC 9732并被菊粉酶更改分支结构后的M-levan(分支度在12.3% ～4.2%之间)对肿瘤细胞的抗性，发现随分支程度的降低M-levan对SNU-1的抗性呈线性递减，对HepG 2的抗性先随分支程度的降低至9.3%而快速减弱，然后随M-levan分支度的进一步降低抗性却略有回升［4］。2012年，Dahech等也发现来源于地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)的Levan在高浓度(50～200 mg/mL)时具有显著的体外抗肿瘤HepG2 的活性［5］。
在抗病毒活性方面，2011年Esawy等研究了来源于6株芽孢杆菌K、M、A、C、E和G的Levan(分子量分别 为 40.938、71.887、43.487、154.638、77.753 和14.200 kDa)的抗病
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毒活性，其中K-、M-和E-levan具有抗鸡流感病毒 HPAI H5N1的活性，但是，K-、M-和E-levan只有与H5N1混合并孵育1 h后再接种九天龄的胚胎鸡蛋才具有抗H5N1的活性，当3种Levan在和H5N1混合后立即接种胚胎蛋或H5N1接种胚胎蛋1 h后再将 Levan接入都不具有此活性;而 A-levan和M-levan具有抗腺病毒40的活性，其抗病毒活性达到50% ～60%［6］。
Levan也具有降血糖活性。2011年，Dahech等发现来源于地衣芽孢杆菌的Levan可以有效抑制糖尿病小鼠的高血糖症，Levan处理后的糖尿病小鼠肝糖原增加了52%、血浆葡萄糖降低了52%;并且，处理后的糖尿病小鼠的肝脏、肾脏、胰腺和心脏中的硫代酸反应物质(TBARS)、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶水平都发生了变化，TBARS分别降低了31%、41%、39%、25%，SOD分别增加了40%、50%、44%、34% ，过氧化氢酶增加了 18% 、20% 、12% 、18%［7］。
Levan还具有降血脂活性。2012年，Belghith等发现来源于地衣芽孢杆菌的Levan具有潜在的降血脂和抗氧化作用，将Levan按每日5%量喂食Wistar鼠，结果发现以高胆固醇食物为食老鼠肝脏的抗氧化酶(CAT和SOD)活性明显增加，老鼠肝脏的TBARS水平降低 33%［8］。
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此外，Levan还具有免疫增强活性。2007年，Rairakhwada等用巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)1发酵生产的Levan饲养鲤鱼，结果表明0.5%的Levan对鲤鱼有较强的免疫刺激作用，可以明显提高红血球数和血红蛋白量;并且，当鲤鱼被嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)感染后，Levan(0.5%)处理可以100%提高它们的存活率［9］。2010年，Liu等发现地衣芽孢杆菌8－37－0－1发酵生产的Levan具有明显的体外刺激小鼠脾淋巴细胞增殖的活性，并且该活性在50～800 ug/mL范围内具有剂量依赖性［10］。
mp3复读机1.2 食品和其它方面
Levan是功能性食品的重要组成部分，不易被人体消化，且热量低，还可以用作为脂肪的替代物，用于制备营养食品，添加在酸奶、冰激凌和果冻布丁等食品中。Levan也是生产低聚果糖类益生元最有潜力的原材料，具有选择性地刺激宿主肠道双歧杆菌增殖、提高双歧杆菌活力、抑制病原菌生长、维持肠道菌平衡等功能［11，12］。另外，作为天然的低热量甜味剂，Levan 也可以应用在焙烤食品、糖果、乳制品及调味料等食品领域。
来源于运动发酵单胞菌的Levan具有与透明质酸一样的保湿效果;它具有与透明质酸对人体纤维原细胞和角化细胞相似的增殖作用，0.01 mg/mL和0.05 mg/mL的Levan都可以提高细
胞的存活力;同时，它也具有消炎作用，生物人造皮肤用Levan(0.01 mg/mL、0.05 mg/mL)与十二烷基硫酸钠(SLS)共同处理比单独用SLS处理分泌的白介素(IL－1)少得多。因此，Levan作为化妆品添加剂具有潜在的应用价值［13］。
2 Levan果聚糖的生产方式
Levan的生产目前有化学法合成、微生物发酵液提取及酶法合成3种方式。
2.1 化学法合成
2002年，Oscarson和Sehglmeble首次用化学方法合成了具有Levan和菊糖结构的寡糖单元［14］。他们先制备出可在β位产生立体专一键合和在糖环1位、6位继续反应的供体6-乙酰基-3-苄基-1，4-(1，1，3，3-四异丙基二硅氧烷基)-2-乙巯基-β-D-呋喃果糖，然后用助催化剂DMTST(二甲基甲巯基锍盐三氟甲基磺酸盐)催化供体与只有6位或1位未被甲基化的受体(β-D-呋喃果糖苷)发生糖基化反应，立体专一性合成了Levan二糖甲苷和菊二糖甲苷，产率分别为80%和86%。然后将两种二糖甲苷的保护基团(二硅氧烷基和醋酸基)去除，得到新的双糖受体，再与供体偶联生成Levan三糖甲苷(产率65%)和菊三糖甲苷(产率67%)，
去保护后成为甲基化的Levan三糖和菊三糖。但是，目前用该方法合成的Levan仅仅是β-糖苷键连接而成的三糖结构。
2.2 微生物发酵液提取
植物和微生物都能合成levan果聚糖，但高分子量Levan主要由微生物发酵产生，如:果聚糖微杆菌［1］、水生拉恩氏菌［3］、费氏葡糖杆菌(Gluconobacter frateurii)［15］和运动发酵单胞菌［16，17］等均可以产生 Levan。微生物发酵生产Levan多糖具有生产周期短，不受季节、地域和病虫害等条件限制等优势。将Levan多糖产生菌株接入高浓度蔗糖培养基中发酵培养，一定时间后离心去除菌体，发酵上清液用乙醇、异丙醇等有机溶剂沉淀，静置过夜、离心即可获得多糖粗品。
不同菌株发酵生产Levan的产量不同，一般在15～50 g/L范围内，但是蔗糖转化成Levan的转化率不高，少数达到41.7%(表1)，这可能由于微生物发酵过程中蔗糖底物不仅用于Levan的合成，菌体的生长及其他副产物的形成均需要消耗底物，故实际获得的多糖产量达不到预期值。
表1 微生物发酵生产Levan果聚糖Table 1 Levan obtained from some strainsStrain Sucrose(g/L)pH T(℃)Time(h)Levan(g/L)Substrate convertion rate(%)Zymomonas mobilis ATCC 31821［16］ 250 —25 24 21.685 8.67 Zymomonas mobilis B4286 ZML1［17］ 150 6 30 24 21.6 14.4 Zymomonas mobilis B4286 ZML2［17］ 150 6 30 24 20.0 13.3 Bacillus subtilis(natto)Takahashi［18］ 200 7 37 21 40 － 50 20 － 25 Zymomonas mobilis ATCC10988 mutant HL 29［19］ 200 — 7 696 41 20.5 Pseudomonas fluorescens［20］ 60 — 28 ±2 144 15.42 25.7 Bacillus licheniformis［21］ 100 5.0 30 24 41.7 41.7 Bacillus subtilis(natto)Takahashi［22］250 6.0 37 55 50－60 20－24
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