芹菜素衍生物在制备抗肾癌药物中的应用

1.本发明属于药物技术领域，具体涉及芹菜素衍生物在制备抗肾癌药物中的应用。

背景技术：

2.芹菜素(apigenin,apg)主要存在于卷柏科、瑞香科、马鞭草科植物中，如卷柏，芫花中含量较大，是一种天然黄酮类化合物，具有抗肿瘤、抗氧化、抗炎、防治心血管疾病和骨质疏松、抗菌等多种生物活性。近年来通过药理研究发现，芹菜素抗肿瘤作用明显，可抑制肿瘤细胞生长，诱导肿瘤细胞凋亡，并可抑制肿瘤血管形成、侵袭和转移，此外，还能干扰肿瘤细胞的信号传导途径。芹菜素在抗肿瘤方面的应用备受关注。随着肿瘤发病率的上升和耐药性的产生，人们需要开发新型的抗肿瘤药物。与其他黄酮类物质(槲皮素、黄酮)相比，芹菜素来源广、价格低廉、低毒、无诱变性以及具有广泛的活性的优势吸引了药物化学家们，对芹菜素修饰和改性，以期筛选出效果好、生物利用度高的抗肿瘤药物。
3.肾细胞癌(renal cell carcinoma,rcc)简称肾癌，是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一，占成人肾脏恶性肿瘤的80％，发病率居泌尿系统肿瘤的第二位(ca cancer j clin,2007,57(l),43-66)，每年全世界约9.5万人死于肾癌(expert rev anticancer ther,2008,8(1),63-73)。近年来，随着生活方式的改变和生活环境的改变，rcc的发病率和死亡率均呈上升趋势。肾细胞癌起源于肾脏的肾小管或集合管的上皮细胞，具有不同的病理类型，大多数肾细胞癌是肾透明细胞癌(renal clear cell carcinoma,rccc,占70％-80％)。
4.rcc对于传统的化疗、放疗并不敏感。随着诊治水平的提高和临床药物的革新，尤其随着分子遗传学的发展，越来越多的分子信号通路被发现在rcc中行使着重要的功能。在此基础上，世界各国批准了越来越多的靶向药物如靶向抑制多酪氨酸激酶的抑制剂药物(如舒尼替尼)等用于晚期转移性rcc的。肾癌的诊治近年来取得了一定疗效与这些分子靶向药物的使用密不可分。因为患者通过免疫获益极其有限，所以对于rcc尤其是中晚期转移性rcc，靶向药物已成为各大指南推荐的策略，也成为晚期肾癌的一线手段。因此，研究肾细胞癌的靶向药物迫在眉睫。
5.c-met(又称met)是酪氨酸激酶受体(receptor tyrosine kinase,rtk)，与其特异性配体肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,hgf)相结合后，发生同源二聚化和磷酸化，从而发挥相应的作用。c-met与hgf结合后激活一系列通路，包括pi3k/akt通路、ras/raf/mek/erk通路以及黏着斑激酶(focal adhesion kinase,fak)通路等。hgf/met是调控血管生成、细胞周期、细胞增殖以及细胞侵袭转移等的重要信号通路。尽管c-met在正常生理条件下对于维持组织稳态十分重要，但是c-met突变、扩增以及过表达等变化，造成其在人类肿瘤中异常激活。研究发现c-met在肾透明细胞癌(renal clear cell carcinoma,rccc)和肾乳头状细胞癌(renal papillary cell carcinoma,rpcc)中均过表达。c-met的表达水平与rcc的病理特性以及疾病的预后转归关系密切。因此，c-met抑制剂作为rcc的靶向药物纷纷进入临床试验阶段。
6.中国专利申请cn 108299365 a公开了式(i)所示化合物具有阿尔茨海默病的
作用，但现有技术没有公开或启示式(i)所示化合物具有或预防癌症包括肾细胞癌，尤其是肾透明细胞癌的用途，以及作用机制。
7.

技术实现要素：

8.本发明提供了芹菜素衍生物在制备抗肾癌药物中的应用，具体涉及式(ⅱ)所示化合物作为抗肾癌药物的应用。
9.为了解决上述技术问题，本发明的技术方案如下：
10.一种芹菜素衍生物在制备抗肾癌药物中的应用，所述芹菜素衍生物的结构式如下：
[0011][0012]
其中，r1、r2、r3分别独立选自：氢、c1-c6烷基或卤素；r4选自：h、d、卤素、oh、och3、cn、no2、nh2、c1-c6烷基、c1-c6烷基或取代的c1-c6烷基；所述取代的c1-c6烷基的取代基选自卤素、羟基、硝基、氨基或苯环。
[0013]
优选的，所述r1、r2为氢。
[0014]
优选的，所述r1、r2为甲烷、乙烷或丙烷中的任意一个。
[0015]
优选的，所述r3、r4为c1-c6烷基。
[0016]
优选的，所述r3、r4为甲烷、乙烷或丙烷中的任意一个。
[0017]
优选的，所述芹菜素衍生物的结构式如下：
[0018][0019]
优选的，所述肾癌为肾细胞癌。
[0020]
优选的，所述肾细胞癌是肾透明细胞癌。
[0021]
本发明还提供了式i或式ⅱ化合物在制备抑制met的磷酸化的药物中的应用。
[0022]
如上所述的药物的剂型为：片剂、丸剂、胶囊剂、颗粒剂、粉剂、散剂、溶液、混悬液、膏剂、脂质体、冲剂、口服剂、注射液、注射剂、靶向给药注射剂、栓剂、贴剂、喷雾剂、洗剂、滴剂或擦剂。
[0023]
本发明的任一方面的任一实施方案，可以与其它实施方案进行组合，只要它们不会出现矛盾。此外，在本发明任一方面的任一实施方案中，任一技术特征可以适用于其它实施方案中的该技术特征，只要它们不会出现矛盾。
[0024]
前面所述内容只概述了本发明的某些方面，但并不限于这些方面。这些方面及其他方面的内容将在下面作更加具体完整的描述。
[0025]
下面对本发明做进一步的解释：
[0026]
本发明以芹菜素为母体结构，合成了一系列芹菜素衍生物，并研究了其抗癌活性，其中评估了它们对caki-1人肾癌细胞系的活性，发现不同的芹菜素衍生物的活性差异较大，与芹菜素相比，有的化合物比芹菜素活性好，而有的化合物比芹菜素活性差。其中，式(ⅱ)所示化合物在caki-1细胞中表现出优异的抗细胞活性作用。并对式(ⅱ)所示化合物抗肾细胞癌的作用机制进行了大量研究实验，发现其作用机制与抑制met的磷酸化有关。本发明化合物分子的5-羟基-酮结构与met激酶铰链区氨基酸残基m1160形成两个经典的氢键，此外，5-羟基-酮结构与i1084、y1159和m1211有疏水相互作用。4-羟基苯结构位于由v1092、l1140、l1157和y1230的侧链组成的疏水口袋，其上的羟基与y1230有氢键作用。4-乙酰苯基占据由m1211、y1230和d1231组成的疏水口袋，与3个氨基酸残基存在疏水相互作用。因此，从分子对接角度来说，本发明的化合物可以直接结合met激酶结构域，从而通过抑制met的磷酸化抑制肾癌。
[0027]
本发明的有益效果为：
[0028]
实验结果表明，式(ⅱ)所示化合物具有很好的体外抑制caki-1细胞生长的作用，在caki-1细胞中呈剂量依赖性显著地抑制p-met(y1234/y1235)蛋白表达水平，但对met总蛋白几乎没有影响。式(ⅱ)所示化合物的作用机制与抑制met的磷酸化有关，在体内通过抑制met的磷酸化发挥其抑制caki-1细胞裸鼠移植瘤生长的作用。式(ⅱ)所示化合物在肾细胞癌中的应用前景广泛，也为肾细胞癌的提供了更多的药物选择。
附图说明
[0029]
图1为apg及式(i)所示化合物对caki-1细胞3-d肿瘤微球生长的影响图；黑箭头
为原始的3-d肿瘤微球，灰箭头为新生的3-d肿瘤微球；
[0030]
其中，图1(a)为空白组，图1(b)为处理组，图1(c)为对照组；
[0031]
图2为式(i)所示化合物与met激酶结构域的分子对接图；
[0032]
图3为蛋白质印迹法检测梯度浓度的式(i)所示化合物和apg对caki-1细胞中met和p-met(y1234/y1235)蛋白质表达水平的影响图；
[0033]
图4为式(i)所示化合物(20mg/kg)、apg(20mg/kg)和溶媒组给药16天后小鼠的肿瘤对比图；
[0034]
图5为式(i)所示化合物(20mg/kg)、apg(20mg/kg)和溶媒组给药16天后小鼠的肿瘤重量分析图(注：数据用平均值
±
标准差表示，n＝6，*表示p《0.05，具有显著性差异。n.s.表示p》0.05，无显著性差异)；
[0035]
图6为免疫组化实验检测肿瘤中met和p-met-y1234/y1235蛋白质表达水平图。
具体实施方式
[0036]
定义和一般术语
[0037]
现在详细描述本发明的某些实施方案，其实例由随附的结构式和化学式说明。本发明意图涵盖所有的替代、修改和等同技术方案，它们均包括在如权利要求定义的本发明范围内。本领域技术人员应认识到，许多与本发明所述类似或等同的方法和材料能够用于实践本发明。本发明绝不限于本发明所述的方法和材料。在所结合的文献、专利和类似材料的一篇或多篇与本技术不同或相矛盾的情况下(包括但不限于所定义的术语、术语应用、所描述的技术，等等)，以本技术为准。
[0038]
应进一步认识到，本发明的某些特征，为清楚可见，在多个独立的实施方案中进行了描述，但也可以在单个实施例中以组合形式提供。反之，本发明的各种特征，为简洁起见，在单个实施方案中进行了描述，但也可以单独或以任意适合的子组合提供。
[0039]
除非另外定义，本发明所使用的所有专业术语或专业词汇具有与本发明所属领域技术人员的通常理解相同的含义。本发明涉及的所有专利和公开出版物通过引用方式整体并入本发明。
[0040]
术语“药物组合物”表示含有有效量的一种或多种所述化合物及其药学上可接受的互变异构体、氮氧化物、水合物、溶剂化物、或药学上可接受的盐，与其他药学上可接受的载体的混合物。将所述化合物制备成药物组合物的目的是为了更方便地向受试对象给药。
[0041]
术语“药学上可接受的”是指这样一些化合物、原料、组合物和/或剂型，它们在合理医学判断的范围内，适用于与患者组织接触而无过度毒性、刺激性、变态反应或与合理的利益/风险比相对称的其他问题和并发症，并有效用于既定用途。
[0042]
术语“受试对象”是指动物。典型地所述动物是哺乳动物。受试对象，例如也指灵长类动物(例如人类，男性或女性)、牛、绵羊、山羊、马、犬、猫、兔、大鼠、小鼠、鱼、鸟等。在某些实施方案中，所述受试对象是灵长类动物。在其他实施方案中，所述受试对象是人。
[0043]
本技术中术语“药盒”或“试剂盒”可互换使用。本技术公开了包含有效量的所述剂或药物组合物的药盒。根据本技术的某些实施方式，所述药盒还包含一种或多种其他的剂。根据本技术的某些实施方式，所述药盒还包含使用说明书。根据本技术的某
些实施方式，所述药盒还包含用于相应给药方式的装置，例如但不限于针头。
[0044]
本发明中式(i)所示化合物可将其制备成药学上允许的任意一种剂型，包括但不限于片剂、丸剂、胶囊剂、颗粒剂、粉剂、散剂、溶液、混悬液、膏剂、脂质体、冲剂、口服剂、注射液、注射剂、靶向给药注射剂、栓剂、贴剂、喷雾剂、洗剂、滴剂或擦剂等。所述药物组合物可制成干粉形式，并且在给药前与无菌水或缓冲液混合以制成溶液形式。所述缓冲液的ph通常为4-11，优选为5-10，更优选为7-9。
[0045]
术语“给药”、“给予”或“施予”是指将一定剂量的化合物或药物组合物通过合适的给药方式给予受试对象。
[0046]
所述“给药方式”包括但不限于口服给药、舌下给药、静脉内给药、局部给药、呼吸道内给药、肌肉内给药、眼内给药、鞘内给药、颅内给药、皮下给药、经皮给药、皮内给药、胃肠外给药、腹膜内给药、硬膜上给药、颊部给药、阴道给药、经直肠给药等本领域已知的任何给药方式。本领域技术人员应该了解对象的给药方式取决于多个因素，所述因素包括对象的年龄、疾病的位置、疾病的严重程度、以及药物组合物的成分等。
[0047]
在本技术中当“大约”或“约”用于修饰数值时，是指所述数值可以上下浮动
±
1％、
±
2％、
±
3％、
±
4％、
±
5％、
±
6％、
±
7％、
±
8％、
±
9％或
±
10％的范围内。
[0048]
除非在本技术中另有说明或与上下文明显矛盾，在描述本技术的上下文中(包括权利要求的上下文中)使用的术语“一”、“一种”、“所述”、“该”、“一个”以及“至少一个”和类似指代被解释为覆盖单数和复数，即“一个或多个”。因此，本发明所使用的这些冠词是指一个或多于一个(即至少一个)宾语的冠词。例如，“一组分”指一个或多个组分，即可能有多于一个的组分被考虑在所述实施方案的实施方式中采用或使用。除非在本技术中另有说明或与上下文明显矛盾，本技术中所使用的术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”被解释为开放式术语(即“包括但不限于”)。除非在本技术中另有说明或与上下文明显矛盾，本技术所述的所有方法可以根据本领域技术人员的理解，以任何合适的顺序进行。
[0049]
本技术中引用的所有专利、专利申请和参考文献均通过引用的方式全文并入本技术，其并入程度就如同每一篇文献单独引用作为参考。当本说明书的公开内容与引用文献有差异时，以本说明书的公开内容为准。
[0050]
以下结合具体实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的保护范围并不局限于这些实施例。
[0051]
本发明所使用的caki-1细胞(产品号htb-46tm)购于美国模式培养物集存库(american type culture collection，atcc)。
[0052]
caki-1：在1971年由具有肾透明细胞癌的49岁白人男性中的转移病灶(皮肤)建立caki-1细胞系。caki-1是表现出上皮细胞形态的人透明细胞肾细胞癌(ccrcc)系并在贴壁培养中生长。当在transwell过滤器上生长时，这些细胞形成在顶面上具有微绒毛的极化单层并表现出近端小管上皮的特有特征。此外，caki-1细胞也是可用于研究肾癌的模型。它们对5-氟尿嘧啶和索拉非尼(vegfrs 1-3、pdgfr-b和raf-1的多激酶抑制剂)比caki-2细胞更敏感。caki-1细胞表达野生型von hippel-lindau(vhl)肿瘤抑制蛋白并已知在免疫受损小鼠中形成肿瘤。
[0053]
本发明所使用的apg(产品号hy-n1201)购自mce(medchemexpress)公司。
[0054]
本发明所使用的式(i)所示化合物、化合物a、化合物b和化合物c是参考专利
cn108299365a中的化合物i-2c合成的。
[0055]
实施例1对caki-1细胞增殖的抑制作用
[0056]
方法一：cck-8实验检测caki-1细胞活力
[0057]
实验方法：
[0058]
细胞活力测定试剂盒购自dojindo molecular technologies(ck04)。将6
×
103个caki-1细胞接种到96孔板内，并与空白对照(0.5％dmso)、不同浓度的apg或不同浓度的各化合物孵育72小时。然后加入最终浓度为10％(v/v)的cck-8工作液，放于37℃、5％co2培养箱继续培养1-2小时，然后使用酶标仪在450nm波长处检测吸光度值。
[0059]
数据处理：
[0060]
根据所测吸光度值计算各化合物的细胞增殖抑制率(inhibition ratio,ir)，计算公式如下：
[0061]
ir％＝[ac
–
ad]/[ac
–
ab]
×
100％
[0062]
ab：空白组，含0.5％dmso、cck-8和无细胞的培养基的孔的吸光度
[0063]
ad：实验组，含0.5％dmso、cck-8、药物和有细胞的培养基的孔的吸光度
[0064]
ac：对照组，含0.5％dmso、cck-8和有细胞的培养基的孔的吸光度
[0065]
采用graph pad prism5软件分析数据及作图，计算各化合物在72小时的半数抑制浓度(ic50)。实验结果见表1。
[0066]
表1本发明化合物对caki-1细胞增殖的抑制作用结果
[0067]
[0068][0069]
实验结果表明本发明式(i)所示化合物具有很好的体外抑制caki-1细胞生长的作用，且抑制作用明显优于apg、化合物a、化合物b和化合物c。
[0070]
方法二：caki-1细胞三维(3-d)肿瘤微球生长实验
[0071]
实验方法：
[0072]
1)取对数生长期的caki-1细胞以4
×
103个/孔接种到u型底的96孔板(thermofisher scientific，168136)中。
[0073]
2)放于37℃、5％co2培养箱培养4天可形成3-d肿瘤微球。
[0074]
3)分别加入0μm和5μm的式(i)所示化合物或5μm的apg继续孵育9天。
[0075]
4)用显微镜(nikon，ts2r-fl)100x进行拍照。
[0076]
实验结果如图1所示：
[0077]
在3-d细胞微球生长实验中，将caki-1细胞培养在u形的96孔板中，4天后肿瘤细胞
会形成3-d微球(图1(a)，黑箭头)，不给药空白组再继续培养9天后肿瘤细胞在最初的微球边上再生长出新的微球(图1(a)，灰箭头)，5μm式(i)所示化合物处理组明显地抑制新的肿瘤微球形成(图1(b))，而5μm apg对照组依然可以再生长出新的肿瘤微球(图1(c))。综合以上实验结果表明，式(i)所示化合物具有很好的体外抑制caki-1细胞生长的作用，且抑制作用明显优于apg。
[0078]
实施例2与met激酶结构域结合实验
[0079]
实验目的：
[0080]
利用分子对接验证式(i)所示化合物是否结合met激酶结构域。
[0081]
实验方法：
[0082]
1)蛋白结构准备。采用schrodinger程序的“protein preparation wizard”模块对蛋白结构进行预处理。(1)从pdb数据库下载的3f66结构包含a、b两条链，每条链都含有一个配体结合位点。选用a链作为分子对接计算的蛋白结构，删除b链及复合物中的结晶水。(2)在“import and process”中，选择“remove original hydrogens”，其余采用默认设置，对蛋白结构加氢、设置化学键类型及在一定ph条件下生成配体分子的质子化状态。(3)在“refine”中，首先采用默认设置优化氢键网络，然后采用默认设置对蛋白结构进行限制性优化。最终蛋白分子存储为mae格式。
[0083]
2)配体结构准备。在maestro11.5中，用“3d builder”构建式(i)所示化合物分子的三维结构，用schrodinger程序的“ligprep”模块对式(i)所示化合物分子进行处理，最终配体分子存储为mae格式。
[0084]
3)分子对接参数设置。在“settings”设置对接精度为xp(extra precision，高精度)模式，对接输出的最大构象数目设置为20，对接后优化构象的数目设置为100，其余采用默认设置。受体活性位点网格使用晶体结构中配体及默认参数产生。
[0085]
实验结果：
[0086]
分子对接结果如图2所示，式(i)所示化合物分子的5-羟基-酮结构与met激酶铰链区氨基酸残基m1160形成两个经典的氢键，此外，5-羟基-酮结构与i1084、y1159和m1211有疏水相互作用。4-羟基苯结构位于由v1092、l1140、l1157和y1230的侧链组成的疏水口袋，其上的羟基与y1230有氢键作用。4-乙酰苯基占据由m1211、y1230和d1231组成的疏水口袋，与3个氨基酸残基存在疏水相互作用。因此，从分子对接角度来说，式(i)所示化合物可以直接结合met激酶结构域。
[0087]
实施例3抑制met磷酸化
[0088]
实验目的：
[0089]
采用蛋白质印迹的方法检测式(i)所示化合物对caki-1细胞met总蛋白和p-met(y1234/y1235)蛋白表达水平的影响。
[0090]
实验方法：
[0091]
蛋白质印迹法分析(western blotting)
[0092]
1)取对数生长期的caki-1细胞以2
×
105个/孔接种到6孔板中，使用0.00、1.25、2.50、5.00、10.0和20.0μm的式(i)所示化合物或apg处理caki-1细胞，放于37℃、5％co2培养箱培养过夜。
[0093]
2)收集细胞，pbs洗涤一次。
[0094]
3)加入200μl 2
×
sds缓冲液放于95℃孵育5min快速裂解细胞。
[0095]
4)采用bca试剂盒进行蛋白定量。
[0096]
5)根据每个槽中加入30μg蛋白来配制电泳样品。
[0097]
6)sds-page电泳，电压100v，时间110min。
[0098]
7)采用湿法转膜，三明治夹层为海绵-滤纸-胶-聚乙烯膜(biorad,1620177)-滤纸-海绵，电压110v，时间100min。
[0099]
8)用5％bsa/pbst缓冲液封闭1小时。
[0100]
9)孵育一抗：根据1:1000的稀释比例用5％bsa/tbst缓冲液配制一抗，将聚乙烯膜放入一抗溶液中4℃孵育过夜。本发明所使用到的一抗购自cell signaling technologies公司，包括met(#8198)，p-met-y1234/y1235(#3077)，
[0101]
10)孵育二抗：回收一抗，pbst洗涤10min
×
3次。用过氧化物酶偶联的二抗(抗igg-hrp，1:5000，cst，#7074或#7076)在室温下孵育1小时。
[0102]
11)pbst洗涤10min
×
3次，使用增强的ecl蛋白质印迹检测试剂(thermofisher scientific，supersignal west dura，34076)进行显影。
[0103]
12)使用化学发光系统(biorad，chemidoc xrs+)捕获照片。
[0104]
13)使用image j(nih)测量每个蛋白条带的灰度值来定量分析。
[0105]
实验结果：
[0106]
实验结果见图3，表明caki-1细胞中式(i)所示化合物呈剂量依赖性显著地抑制p-met(y1234/y1235)蛋白表达水平，但对met总蛋白几乎没有影响。
[0107]
实施例4抑制体内caki-1细胞移植瘤生长和met磷酸化
[0108]
实验目的：
[0109]
由于式(i)所示化合物表现出很好的体外抗caki-1细胞增殖的作用，为了进一步研究式(i)所示化合物的抗caki-1细胞活性，选用caki-1细胞裸鼠异种移植瘤模型来评价式(i)所示化合物在体内的抗肿瘤活性和抑制met磷酸化活性。
[0110]
实验方法：
[0111]
首先，将caki-1细胞(1
×
107个细胞重悬于50μl无血清rpmi+50μl基质胶中)接种至裸鼠右背部皮下，待肿瘤生长至200mm3左右，测量肿瘤的体积和小鼠的重量，根据肿瘤的体积和小鼠重量随机分为三组，每组6只，保证三组的肿瘤体积和体重相当。每天采取腹腔注射的方法给予式(i)所示化合物(20mg/kg)、apg(20mg/kg)和相应体积的溶媒(含5％dmso和15％peg400的生理盐水，ph＝9)，连续给药16天后测量小鼠的体重，然后处死小鼠解剖取出肿瘤拍照和称重。
[0112]
然后取肿瘤组织进行免疫组化实验，具体步骤如下。
[0113]
免疫组化实验
[0114]
1)将肿瘤组织放于福尔马林中备用或长期保存。
[0115]
2)石蜡包埋：将肿瘤组织从福尔马林中取出用梯度浓度(75％，95％和100％)的乙醇、二甲苯和石蜡依次浸泡进行脱水处理，脱水后用融化的石蜡包埋。
[0116]
3)石蜡凝固后用石蜡切片机切片，用切片机切成3微米厚度的切片，然后将切片附着在玻片上。
[0117]
4)将载有切片的玻片用二甲苯、无水乙醇、95％乙醇、85％乙醇、75％乙醇、pbs依
次浸泡进行脱蜡水化处理。
[0118]
5)脱蜡水化后的载有切片的玻片用tris/edta修复液进行抗原修复：微波炉加热修复液到100℃，将玻片架放入煮沸的修复液中，盖好盖子，采用5-3-5的方式加热(中火加热5分钟，停3分钟，再加热5分钟)。加热完后取出容器放置水中冷却10分钟。抗原修复后蒸馏水洗涤2次*5min，pbs洗涤2次*5min。
[0119]
6)在含0.025％triton x-100(25μl/100ml)的tbs中漂洗玻片10分钟，上下轻轻震荡，pbs洗涤3次*5min。
[0120]
7)用含10％血清、1％bsa(称500mg bsa固体配50ml)的tbs(100-200μl)室温封闭2小时。晾干封闭液(不是漂洗)，并用纸巾将玻片周围擦干。
[0121]
8)加入稀释好的一抗，met抗体(cell signaling technologies，#8198)和p-met-y1234/y1235抗体(cell signaling technologies，#3077)，置于湿盒在4℃孵育过夜。
[0122]
9)去除一抗液体，蒸馏水洗涤2次*5min，pbs洗涤2次*5min。
[0123]
10)加入二抗(抗igg-hrp，1:5000，cell signaling technologies，#7074或#7076)溶液孵育1h。
[0124]
11)吸弃二抗，蒸馏水洗涤3次*5min，pbs洗涤3次*5min。
[0125]
12)避光加入dab显液显示。
[0126]
13)蒸馏水洗涤一次，然后苏木素复染。
[0127]
14)用75％乙醇、85％乙醇、95％乙醇、无水乙醇、二甲苯依次浸泡进行脱水处理。
[0128]
15)用中性树胶和盖玻片进行封片，并进行后续显微镜下观察拍照。
[0129]
实验结果：
[0130]
与溶媒组小鼠的肿瘤相比，式(i)所示化合物(20mg/kg)给药组16天后肉眼可见小鼠的肿瘤体积明显变小(图4)，重量显著低于溶媒组(图5)，但同等剂量的apg未见有明显的抑制肿瘤的生长。式(i)所示化合物在体内通过抑制met的磷酸化发挥其抑制caki-1细胞裸鼠移植瘤生长的作用(图6)。
[0131]
综上，本发明的化合物明显能够通过抑制met的磷酸化发挥其抑制肾癌的作用。
[0132]
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一实施方案”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”或“一些示例”等的描述意指结合该实施例、实施方案或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例、实施方案或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例、实施方案或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例、实施方案或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例、实施方案或示例以及不同实施例、实施方案或示例的特征进行结合和组合。
[0133]
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

技术特征：

1.一种芹菜素衍生物在制备抗肾癌药物中的应用，其特征在于，所述芹菜素衍生物的结构式如下：其中，r1、r2、r3分别独立选自：氢、c1-c6烷基或卤素；r4选自：h、d、卤素、oh、och3、cn、no2、nh2、c1-c6烷基、c1-c6烷基或取代的c1-c6烷基；所述取代的c1-c6烷基的取代基选自卤素、羟基、硝基、氨基或苯环。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述r1、r2为氢。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述r1、r2分别独立为甲烷、乙烷或丙烷中的任意一个。4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述r3、r4分别独立为c1-c6烷基。5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述r3、r4分别独立为甲烷、乙烷或丙烷中的任意一个。6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述芹菜素衍生物的结构式如下：7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肾癌为肾细胞癌。8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肾细胞癌是肾透明细胞癌。9.如式i或式ⅱ所示的芹菜素衍生物在制备抑制met的磷酸化的药物中的应用。10.根据权利要求1-9任一项所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型为：片剂、丸剂、胶囊剂、颗粒剂、粉剂、散剂、溶液、混悬液、膏剂、脂质体、冲剂、口服剂、注射液、注射剂、靶向给药注射剂、栓剂、贴剂、喷雾剂、洗剂、滴剂或擦剂。

技术总结

本发明公开了芹菜素衍生物在制备抗肾癌药物中的应用，具体地，本发明首次公开了式(Ⅱ)所示化合物作为抗肾细胞癌药物的应用。实验结果表明，本发明的化合物的作用机制与抑制MET的磷酸化有关，在体内通过抑制MET的磷酸化发挥其抑制Caki-1细胞裸鼠移植瘤生长的作用。本发明的化合物在肾细胞癌中的应用前景广泛，也为肾细胞癌的提供了更多的药物选择。细胞癌的提供了更多的药物选择。