叶酸的新用途的制作方法

1.本发明涉及一种药品或保健食品，更具体地，本发明涉及叶酸非酒精 性脂肪肝的新用途。本发明属于药品或保健食品领域。

背景技术：

2.脂肪肝是指由于各种原因引起的肝细胞内脂肪堆积过多而造成的病变，分 为酒精性脂肪性肝病、非酒精性脂肪性肝病(nafld)，前者与长期饮酒有关， 而后者是一种与胰岛素抵抗和遗传易感密切相关的代谢应激性肝损伤。nafld是 目前最常见的慢性肝病，影响全球至少四分之一成年人。随着肥胖和代谢综合 征的流行，nafld患病率明显上升，已成为我国主要的慢性肝病之一，也是健康 查体时肝酶异常的首要原因。nafld不仅可以导致肝病相关残疾和死亡，还与代 谢综合征、2型糖尿病、动脉硬化性心血管疾病及结、直肠肿瘤等疾病的高发相 关。
3.nafld的进展形式是非酒精性脂肪性肝炎(nash)，可引起持续性肝细胞损 伤，并可进一步导致肝纤维化，甚至进展为肝硬化和终末期肝病。有报道显示 ，在世界范围内，1990年—2017年由nafld引起的肝硬化患者增加了两倍多。
4.叶酸属于b族维生素家族的成员，是机体生长发育所必需的物质，并具有多 种药用功效，例如妊娠前及妊娠早期女性口服小剂量叶酸(0.4mg/日)可预防 新生儿神经管畸形，大剂量叶酸(5
‑ꢀ
15mg/日)可用于叶酸缺乏导致的巨幼红细胞贫血。5
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甲基四氢叶酸是叶酸在体内的活性形式，本发明人在流行病学调研中意外发现 血液5
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甲基四氢叶酸水平与nafld发生风险大小密切相关，并通过动物实验证实5
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甲基四氢叶酸对nafld和肝组织纤维化的改善作用。

技术实现要素：

5.本发明针对非酒精性脂肪肝与叶酸类物质的关系，经过深入分析和实验验 证，提出了一种叶酸类物质在防治非酒精性脂肪肝或肝组织纤维化中的新用途 ，具体的技术方案如下：
6.叶酸类物质在制备防治非酒精性脂肪性肝炎或或辅助肝组织纤维 化的制品中的用途。
7.在本发明中，所述的叶酸类物质包括合成合成叶酸、5
‑ꢀ
甲基四氢叶酸、甲酰四氢叶酸、左亚叶酸钙或叶酸类物质的各种盐类。其中，优 选5-甲基四氢叶酸。
8.在本发明中，所述的5-甲基四氢叶酸可以选自金属盐，包括5
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甲基四氢叶酸钙盐、5-甲基四氢叶酸钠盐、5-甲基四氢叶酸锂盐、5
‑ꢀ
甲基四氢叶酸镁盐、5-甲基四氢叶酸钡盐、5-甲基四氢叶酸钾盐、5
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甲基四氢叶酸铵盐和5-甲基四氢叶酸锌盐。
9.在本发明中，所述的5-甲基四氢叶酸可以是5-甲基四氢叶酸氨基葡萄糖盐。
10.在本发明中，5
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甲基四氢叶酸可以选自无机酸加成盐和有机酸盐，其中无机酸包括盐酸、硫酸、 硝酸、磷酸，有机酸包括甲酸、乙酸、丙酸、二乙基乙酸、丙二酸、琥珀酸、富马
酸 、马来酸、乳酸、酒石酸、苹果酸、柠檬酸、葡糖酸、氨基酸、抗坏血酸或烟酸等。 其中，氨基酸包括缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、氨酸、苯丙氨酸、 苏氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、组氨酸、半胱氨酸、茶氨酸、甲硫氨酸。
11.在本发明中，所述的叶酸类物质为0.1～5mg，优选0.2～2mg，更加优选0.4 ～0.8mg。
12.在本发明中，本发明提供的制品可以是片剂、胶囊剂、粉剂及颗粒剂等口 服剂型。
13.本发明团队经过大量的数据分析，得出总叶酸和5
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甲基四氢叶酸与非酒精性脂肪肝与晚期纤维化呈现负相关的显著关系，本发明 团队在上述研究的基础上，进一步通过动物实验，验证了补充5
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甲基四氢叶酸在非酒精性脂肪肝和肝组织纤维化中相较于其他叶酸形式产 生了意想不到的显著有益作用。
具体实施方式
14.此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
15.实施例1：不同叶酸形式与非酒精性脂肪肝和肝晚期纤维化间关系的横断面分析
16.【方法】
17.本发明团队提取了nhanes(美国营养与健康数据库)2011
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2018的数据，以了解人口的健康和营养状况。
18.在nhanes 2011
‑ꢀ
2018调查的39156名参与者中，我们的分析仅限于18岁以上且当前未怀孕的人。 其中，我们排除了1,925名因继发原因诱发肝脂肪积聚的参与者。我们还排除了 13807名参与者，这些个人缺少血清不同形式叶酸的浓度数据和nafld不同生 物标志物成分或晚期纤维化的数据，包括年龄，性别，种族，腰围(wc)， 体重指数(bmi)，天冬氨酸转氨酶(ast)，丙氨酸转氨酶(alt)，γ
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谷氨酰转肽酶(ggt)，白蛋白，血小板，葡萄糖，胰岛素或糖尿病史。在7,8 46名合格个体中，我们随后排除了1,236名参与者，这些参与者缺少有关潜在混 杂因素的数据，包括家庭收入与贫困水平，教育水平，吸烟状况，婚姻状况， 高血压病史，总胆固醇或高密度脂蛋白胆固醇。因此，最终样本由6,610个人组 成，都具有完整的数据。
19.我们对纳入最终分析的6610个参与者进行抽血检测，测定不同形式叶酸的 浓度，使用美国脂肪肝指数(usfli)对nafld进行检测评估，对于晚期纤维化 使用非侵入性的方法进行评估。
20.【结果与分析】
21.实验结果如下所示：
22.参与者的基线特征如下表所示：
23.表1：根据研究参与者5-mthf四分位数分组的基线特征：a[0024][0025]
[0026][0027]
a对于连续变量，数值表示为平均值
±
se，对于分类变量，数值表示为( ％)。
[0028]
缩写：bmi，体重指数；wc，腰围；ckd，慢性肾脏疾病； plt，血小板；tc，总胆固醇；hdl-c，高密度脂蛋白胆固醇； hba1c，血红蛋白a1c；homa，同稳态模型评估；fpg，空腹血糖； ast，天冬氨酸转氨酶；alt，丙氨酸转氨酶；ggt，γ-谷氨酰转肽酶；5
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mthf，5-甲基四氢叶酸；umfa，未代谢的叶酸。
[0029]
表2：不同形式叶酸与nafld患病率的关系。
[0030]
[0031][0032]
型1：针对年龄，性别，种族/民族进行了调整。
[0033]
模型2：针对年龄，性别，种族/民族，体重指数，腰围，教育水平，婚姻 状况，家庭收入与贫困水平，吸烟状况，高血压和糖尿病病史，总胆固醇和高 密度脂蛋白胆固醇进行了调整使用适当的采样权重。
[0034]
模型3：除了使用适当的采样权重的模型2外，还针对umfa(或当使用um fa作为自变量的情况下，调整为5-mthf)进行了调整。
[0035]
表3:叶酸形式与晚期纤维化患病率的关系
[0036]
[0037][0038]
使用适当的抽样权重，针对年龄，性别，种族/民族，体重指数，腰围，教 育水平，婚姻状况，家庭收入与贫困水平，吸烟状况，高血压和糖尿病病史， 总胆固醇和高密度脂蛋白进行调整。(当使用5
‑ꢀ
mthf作为自变量时，除模型外，对umfa进行了调整；当使用umfa作为自变 量时，对模型中对5-mthf进行了调整)
[0039]
fib-4：晚期纤维化定义为fib-4》3.25分。
[0040]
nfs：晚期纤维化定义为nfs》0.676分。
[0041]
hfs：晚期纤维化定义为hfs≥0.47分。
[0042]
nafld
‑ꢀ
纤维化复合物：晚期纤维化定义为使用高侵袭性肝纤维化可能性高的非侵入性 肝纤维化专门组的三个阳性试验(fib-4，nfs或hfs)中的至少两个。
[0043]
在这个大规模的，具有全国代表性的，随机选择的美国成年人样本中，本 研究首先表明，高血清5
‑ꢀ
mthf水平与nafld患病率降低和晚期纤维化相关，其从上述的试验数据可以 看出，在5
‑ꢀ
mthf较高的四分位浓度q4(≥51.4nmol/l)与较低的四分位浓度q1(＜23.2nm ol/l)～q3(34.5
‑ꢀ
51.4nmol/l)的人相比，患有酒精性脂肪肝与晚期纤维化的显著降低，且从q 1～q4随着5
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mthf浓度的增大，可以看出非酒精性脂肪肝和晚期纤维化发生率不断减低的 趋势。
[0044]
实施例2：5-甲基四氢叶酸对非酒精性脂肪肝模型大鼠的肝功能的影响
[0045]
【材料与方法】
[0046]
实验动物，spf级sd雄性大鼠，8周龄，购自北京维通利华公司。
[0047]
动物分组：选取8只大鼠在实验的整个过程中喂养普通饲料，自由饮水，作 为正常对照组。
[0048]
选取90只大鼠喂养高脂饲料(胆固醇2％，胆酸钠0.5％，丙硫氧嘧啶0.2％ ，蔗糖5％，猪油10％，基础饲料82.3％)。自由饮水。
[0049]
两组大鼠均喂养10周后，眼眶静脉采血，测定大鼠血清谷丙氨酸转移酶( alt)、天门冬氨酸转移酶(ast)、低密度脂蛋白(ldl
‑ꢀ
c)、总胆固醇(tc)、肝组织匀浆谷氨酰转肽酶(ggt)、谷胱甘肽(gsh )。将血清天门冬氨酸转移酶(ast)和总胆固醇(tc)水平与正常对照组相 比同时升高50％以上的造模大鼠作为造模成功大鼠。
[0050]
将造模成功的大鼠依据天门冬氨酸转移酶(ast)水平，兼顾总胆固醇水 平(tc)进
行分层随机分成8组，每组8
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9只。按照下表所示剂量给以本发明所提供的供试品。正常组给以相应的溶媒。 给药16周。灌胃体积按照10ml/kg换算。其中5
‑ꢀ
甲基四氢叶酸钙购自连云港金康有限公司，叶酸购自瑞士帝斯曼(dsm)公司 、5,10
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亚甲基四氢叶酸由北京百灵威科技有限公司购得，本实验中所用剂量均以换算 叶酸的剂量计。
[0051]
给药结束后所有大鼠处死采血，测定血清谷丙氨酸转移酶(alt)、天门 冬氨酸转移酶(ast)、低密度脂蛋白(ldl
‑ꢀ
c)、总胆固醇(tc)、肝组织匀浆谷氨酰转肽酶(ggt)、谷胱甘肽(gsh )水平，并对所有大鼠进行肝脏形态观察。
[0052]
【结果与分析】
[0053]
结果如下：
[0054]
表4：给药本发明提供的受试物16周对非酒精性脂肪肝模型大鼠肝功能指标与血 脂水平的影响
[0055][0056][0057]
与正常对照组相比，
#
p《0.05，
##
p《0.01；与模型组相比，
*
p《0.05，
**
p《0.01。与 5,10-[0058]
亚甲基四氢叶酸组比，
○
p《0.05，
○○
p《0.01；与合成叶酸组比，
□
p《0.05，
□□
p《0.01 。
[0059]
从上述的实验结果可以看出，各剂量的5
‑ꢀ
甲基四氢叶酸对于非酒精性脂肪肝模型大鼠均能显著地降低谷丙氨酸转移酶( alt)、天门冬氨酸转移酶(ast)，但只有高剂量组5
‑ꢀ
甲基四氢叶酸才能显著降低血脂低密度脂蛋白(ldl
‑ꢀ
c)和总胆固醇(tc)。5,10
‑ꢀ
亚甲基四氢叶酸能显著降低非酒精性脂肪肝模型大鼠谷丙氨酸转移酶水平，但 对天门冬氨酸转移酶、低密度脂蛋白和总胆固醇无显著作用。合成叶酸能显著 降低非酒精性脂肪肝模型大鼠谷丙氨酸转移酶和天门冬氨酸转移酶水平，但对 低密度脂蛋白和总胆固醇无显著作
用。通过对叶酸不同衍生物的作用效果进一 步分析发现，5-甲基四氢叶酸在0.05
‑ꢀ
0.2mg/kg的剂量水平降低转氨酶、改善肝功能的效果非常显著地优于合成叶酸 或5，10-亚甲基四氢叶酸，所述结果5
‑ꢀ
甲基四氢叶酸在剂量进一步提高时效果反而减弱，说明相较于其他叶酸，5
‑ꢀ
甲基四氢叶酸对于非酒精性脂肪肝具有非常显著的效果，并且5
‑ꢀ
甲基四氢叶酸改善肝功能的效果与剂量呈现u型的曲线关系。
[0060]
各组大鼠肝组织匀浆ggt、gsh含量变化比较如下表：
[0061]
表5：给药本发明提供的受试物16周对非酒精性脂肪肝模型大鼠ggt，gs h的影响
[0062][0063][0064]
与对照组相比，
#
p《0.05，
##
p《0.01；与模型组相比，
*
p《0.05，
**
p《0.01。与 5,10-[0065]
亚甲基四氢叶酸组比，
○
p《0.05，
○○
p《0.01；与合成叶酸组比，
□
p《0.05，
□□
p《0.01 。
[0066]
从以上的实验结果可以看出，通过高脂造模后，大鼠的ggt与正常组相比 明显的升高，说明模型大鼠肝脏已经是伴随着一定程度的肝炎症状，而模型组 的gsh与正常组相比具有明显的降低，其对肝的保护作用可见减弱。在给以本 发明所提供的5-甲基四氢叶酸的后，各剂量组5
‑ꢀ
甲基四氢叶酸均能够显著降低ggt水平，升高gsh水平，并且呈现u型的曲线 关系。5,10
‑ꢀ
亚甲基四氢叶酸组仅能显著升高gsh水平；合成叶酸能够显著降低ggt水平， 升高gsh水平。与5,10-亚甲基四氢叶酸组比或与合成叶酸相比，5
‑ꢀ
甲基四氢叶酸的对ggt及gsh的改善效果差异非常显著。而在相同剂量下，5
‑ꢀ
甲基四氢叶酸明显优于5,10-亚甲基四氢叶酸组和合成叶酸组的作用效果。
[0067]
各组大鼠的组织学形态变化：肝脏大体形态观察，正常组肝脏表面颜普 遍黯红，泽鲜亮，中等硬度，切面略有颗粒感，无油腻感。模型组肝脏表面 颜发黄，肝脏体积明显增大，包膜紧张，切面有油腻感，无颗粒感。而给药 组中除5
‑ꢀ
甲基四氢叶酸钙低剂量组与模型组相比改变不明显外，均有改善，尤以5
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甲基四氢叶酸钙中剂量及中高剂量组的肝脏形态最接近于正常组。

技术特征：

1.叶酸类物质在制备防治非酒精性脂肪性肝炎的制品中的用途。2.叶酸类物质在制备或辅助肝组织纤维化的制品中的用途。3.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于：所述的叶酸类物质包括合成叶酸、5-甲基四氢叶酸、甲酰四氢叶酸、左亚叶酸钙或叶酸类物质的各种盐类。4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于：所述的叶酸类物质是5-甲基四氢叶酸。5.根据权利要求3所述的用途，其特征在于：所述的5-甲基四氢叶酸的盐类是5-甲基四氢叶酸金属盐，包括5-甲基四氢叶酸钙盐、5-甲基四氢叶酸钠盐、5-甲基四氢叶酸锂盐、5-甲基四氢叶酸镁盐、5-甲基四氢叶酸钡盐、5-甲基四氢叶酸钾盐、5-甲基四氢叶酸铵盐和5-甲基四氢叶酸锌盐。6.根据权利要求3所述的用途，其特征在于：所述的5-甲基四氢叶酸的盐类是5-甲基四氢叶酸氨基酸盐，氨基酸包括缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、组氨酸、半胱氨酸、茶氨酸、甲硫氨酸，还可以是5-甲基四氢叶酸氨基葡萄糖盐。7.根据权利要求1～6任一项所述的用途，其特征在于：所述的叶酸类物质为0.1～5mg，优选0.2～2mg，更加优选0.4～0.8mg。8.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述制品是片剂、胶囊剂、粉剂及颗粒剂等口服剂型。

技术总结

本发明公开了叶酸的新用途。具体地，本发明提供了一种叶酸用于非酒精性脂肪肝和肝纤维化的新用途。本发明的叶酸尤其适用于体内叶酸水平较低的人。内叶酸水平较低的人。

技术研发人员：

李锦良 白洁 张磊 徐希平 田敏卿 秦献辉

受保护的技术使用者：

深圳奥萨医药有限公司

技术研发日：

2021.05.25

技术公布日：

2022/11/24