兽医科技
表4 伊曲康唑凝胶剂对豚鼠皮肤过敏试验平均分值 分组别
6h 24h 48h 72h 伊曲康唑凝胶剂组0000空白凝胶对照组0000阳性对照组
3.75
3.25
3
2.25
表5 致敏率分类保健牙刷
致敏率/%
反应强度0~10弱致敏性20~30轻度致敏性40~60中度致敏性70~80高度致敏性90~100
极度致敏性
药剂量。本试验中低(5m g /g )、中(15m g /g )、高
(20mg /g)3个剂量组的动物病死率均为0，对出现皮肤变化的动物进行剖检未见病理学变化，故认为研制的伊曲康唑凝胶剂(15m g /g)对大鼠皮肤无毒性。
由于所研制的方剂为外用制剂，考察该方剂的皮磁性材料液压机
肤刺激性尤为重要，故试验选取对刺激更敏感的家兔为研究对象，结果表明该方剂对皮肤无刺激性。在致敏试验结果判定中通过计算致敏率来反应伊曲康唑凝胶剂的致敏强度，确定该方剂为弱致敏物质。在观察皮肤刺激性及致敏性试验结果时主要靠肉眼来评判，存在一定的主观性，为尽量降低由主观而产生的误差，每次判定至少由3人以上观察、判读，取平均值。
参考文献:
[1] 李飞.伊曲康唑凝胶剂的研制[D].沈阳：沈阳药科大学,2004.[2] 崔鹏博.奶牛皮肤真菌病病原分离及抗真菌药物的筛选[D].哈
尔滨：东北农业大学,2008.
[3] 徐端正.生物统计在实验和临床药理学中的应用[M ].北京：科
学出版社,2004:363-364.
[4] 周立国.药物毒理学[M ].2版.北京：中国医药科技出版社,
2009:171-176.
[5] 梁运霞，郑海洪，庞淑华.复方中药透皮软膏剂的药理与毒理作
表贴式永磁同步电机用研究[J].中兽医医药杂志,2006(2):12-14.
(009)
收稿日期:2010-03-05；修回日期:2010-11-17基金项目：辽宁省自然科学基金项目(20092066)
作者简介：薛 娜(1983-)，女，硕士研究生,b i ng li ng saha l a@163.
通信作者：沈国顺(1964-)，男，教授，博士.
薛 娜，沈国顺
(沈阳农业大学畜牧兽医学院，辽宁沈阳110161)
中图分类号:S858.28
文献标识码:B
文章编号:1004-7034(2011)01-0092-03
关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒;ORF6基因；核酸疫苗；免疫 摘 要：为了进一步研究PRRSV 新型疫苗，为有效控制PRRSV，试验采用RT -PC R 的方法扩增出PRRSV M 蛋白基因片段ORF6，将该基因克隆到p MD18-T 载体，并通过序列分析软件对其核苷酸和氨基酸同源性进行分析。在此基础上以pI RES -neo 为载体，构建含有ORF6基因的重组核酸疫苗质粒pI RES-ORF6。结果表明：该PRRSV 辽宁分离株属于北美型毒株，重组核酸疫苗质粒pI R ES -ORF6构建成功。 猪繁殖与呼吸综合征(po rcine reproductive and respiratory syndro m e ,PRRS)又称 蓝耳病 ，它是引发猪繁殖障碍和呼吸器官疾病的一种传染病。目前，世界上流行的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV )主要
有2个基因型，即以LV [1]
为代表的欧洲型和以VR2332为代表的美洲型。PRRSV 能损害感染猪的
免疫系统，从而引起免疫抑制，导致继发或并发感染其他疾病，使病情加重。目前该病还没有有效的方法，一旦发病，引起猪的病死率较高。本试验以辽宁地区疑似PRRS 死亡猪的肺脏和淋巴结为材料，提取PRRSV RNA，用RT -PCR 的方法扩增出M 蛋白基因片段ORF6，将该基因克隆到p MD18-T 载体，并通过序列分析软件对其核苷酸和氨基酸同源性进行了分析。在此基础上，以pI R ES -neo 为载体，构建含有ORF6基因的重组核酸疫苗质粒pI R ES -ORF6。
1 材料与方法
92
H eil ong ji ang A n i m al Science
and V eter i nary M ed i c i ne
12011
兽医科技2011年1月(上)
rs232和ttl
1.1 病料、菌株和质粒
病料为临床采集的辽宁地区疑似PRRS死亡猪的肺脏和淋巴结;p MD18-T载体、p MD18-T S i m ple载体，购自宝生物工程(大连)有限公司；转化宿主菌E.coli DH5 和质粒pI R ES-neo，均由沈阳农业大学畜牧兽医学院预防专业实验室保存。
1.2 主要试剂
Taq聚合酶、限制性内切酶(E coR 、Ba m H )、反转录酶(M-MLV)、T4DNA连接酶以及胶回收试剂盒，均为宝生物工程(大连)有限公司产品；质粒小量抽提试剂盒，购自Axygen公司。
1.3 引物的设计
参照国内发表的PRRSV分离株的核苷酸序列自行设计引物(由上海生工生物工程技术服务有限公司合成)，其中P1、P2扩增产物1101bp，包含ORF6基因的全部开放阅读框;P3、P4扩增产物分别引入E co R 、Ba mH 酶切位点(下划线部分)，扩增产物为525bp。引物序列为P15 -ggCgg TATgTCTTg Ag TAgC-3 ,P25 -ACTCCACAgTgTAACTTATCCTC -3 ;P35 -g AATTCATggggTCg TCTCTA-3 ,P45 -gg ATCCTTATTTgg CATATTTA-3 。
1.4 RNA的提取
研磨病料，取上清液按T rizo l试剂说明书提取PRRSV RNA。
1.5 RT-PCR
以提取的总RNA为模板、P2为引物(工作浓度为10pm o l/ L)进行反转录，反应条件:42 45m i n;95 5m i n。再以反转录产物c DNA为模板，以P1、P2为引物进行PCR扩增，反应条件:94 预变性3m i n;94 变性1m i n,58 退火1m i n, 72 再延伸1m i n，共30个循环;72 再延伸10m i n。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳，利用DNA 凝胶回收试剂盒回收含1101bp的ORF6基因片段，置于-20 保存，备用。
1.6 PCR产物的克隆、测序
按照p MD18-T载体说明书将目的基因ORF6与p MD18-T载体连接、转化。碱裂解法提取质粒DNA并进行PCR鉴定。用Ba mH 、H i n d 双酶切鉴定得到预期目的片段。选取阳性克隆质粒委托北京华大生物有限公司进行测序，并将阳性克隆质粒命名为p MD18-T-ORF6。
1.7 序列分析
应用DNAStar软件对测序正确的ORF6基因进行序列分析，并与国内外已发表的PRRSV毒株相应区域核苷酸序列和氨基酸序列进行同源性比较。
1.8 重组质粒pI R ES-ORF6的构建
以P3、P4为引物(工作浓度为10pm ol/ L)，采用PCR方法从p MD18-T-ORF6上扩增目的基因ORF6片段，将其连入p MD18-T S i m p le载体，获得p MD18-T Si m p le-ORF6质粒，进行EcoR 和B a mH 双酶切鉴定和PCR鉴定，结果得到预期大小(525bp)的目的片段，说明构建正确。鉴定正确后用E co R 和Ba mH 分别对p MD-18T S i m p le-ORF6质粒和pI R ES-neo载体酶切，回收目的基因片段ORF6(525bp)和pI RES载体片段(5290bp)，用T4DNA连接酶连接过夜，转化，提取质粒，对重组质粒pI RES-ORF6进行PCR和Eco R /Ba mH 双酶切鉴定。
2 结果
2.1 RT-PCR结果
用设计的特异性引物P1、P2进行RT-PCR，扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳，结果可见大小为1101bp特异性扩增片段，与预期相符，见图1
。
M.DL-2000M aker;1,2.RT-PCR产物。
图1 ORF6基因RT-PCR扩增产物
2.2 ORF6基因序列的测定结果(见图
硬件加速器
密码文具盒2)
注：下划线部分为编码区(525bp)。
图2 ORF6基因序列测定结果
p MD18-T-ORF6测序结果表明:PRRSV辽宁分离株ORF6基因c DNA编码区为525bp，可编码174个氨基酸(见图3)。
2.3 ORF6基因与其他分离株ORF6基因序列同源性比较和遗传进化分析
运用DNAStar软件将ORF6基因以及推导的氨基酸序列与PRRSV欧洲株LV、北美洲株VR-2332和其他部分国内外分离株的核苷酸和氨基酸序列进
93
黑龙江畜牧兽医 科技版
兽医科技
图3 ORF6基因编码的氨基酸序列
行同源性比较，并进行了遗传进化分析，结果见图4~
6。结果表明,PRRS V 辽宁分离株ORF6(LN -ORF6)与VR-2332株的核苷酸、氨基酸同源性分别为94.9%和97.1%，与LV 株的核苷酸、氨基酸同源性分别为69.6%和79.9%，与南韩株(Korea)的核苷酸、氨基酸同源性分别为94.9%和97.1%，与国内分离株AY262352H B-2的核苷酸、氨基酸同源性分别高达96.6%和97.7%，与AY032626CH -1a 的核苷酸、氨基酸同源性分高达为97.0%和97.1%。遗传进化树分析结果表明，该分离株与AY032626C H -1a 、AY262352H B -2等同属于PRRSV 美洲株的一个分支。据此可以推测PRRSV 辽宁分离株属于北美
型毒株。
图4 ORF6
基因核苷酸序列的同源性比较
图5 ORF6
基因氨基酸序列的同源性比较
图6 PRR S V ORF6基因的遗传进化分析
2.4 重组质粒pI R ES-ORF6的酶切及PCR 鉴定
结果
重组质粒pI RES-ORF6分别用E co R 和Ba mH 进行双酶切鉴定，切出目的片段大小525bp ，与预期相符，见图7
。
1.DL-5000M arker ;
2.p I RES -ORF6质粒;
3.E coR +Ba mH
酶切产物;4.ORF6基因PCR 产物。
图7 pI RES-ORF6质粒的酶切及PCR 鉴定
3 讨论
PRRS 是由PRRSV 引起的以母猪繁殖障碍和仔猪呼吸困难为特征的动物传染病。该病于1987年首次在美国发现，之后迅速在全球蔓延。目前，使用的PRRS 疫苗均存在一定程度的缺陷，灭活苗在灭活过程中造成抗原表位的缺失或抗原性减弱，不能产生足
够的免疫保护，常导致免疫失败[2]
。减毒疫苗虽可以很好地刺激机体产生细胞免疫和体液免疫，但驯化的
PRRSV 弱毒株会出现返强现象，造成苗毒散播[3]
，故不提倡使用减毒疫苗。基因疫苗可同时诱导细胞免疫和体液免疫，克服了传统疫苗的缺点，以其安全、高效、廉价的特点为PRRS 疫苗的研制展现了一个崭新的平台。研究表明,PRRSV ORF6基因编码的基质膜
(M )蛋白是欧洲型和美洲型毒株间最保守的蛋白[4]
，并且M 蛋白不但能够诱导产生部分中和抗体，而且与细胞免疫应答有关。因此，试验以pI RES -neo 为表达载体，构建了PRRSV ORF6基因的核酸疫苗，为今后PRRS 新型疫苗的研究提供思路和理论基础。参考文献:
[1] W ENSVOORT G.Lel ystadvirus and the porci ne ep i de m i -cab ortion
and respiratory syndrom e [J].Vet Res ,1993(24):117-124.[2] NIELSEN T L ,N I ELSEN J,HAVE P ,et a.l Exa m i nati on of virus
shedd i ng in se m en fro m vacci nated and fro m prev i ou sl y i n f ect ed boars after experi m en tal challenge w ith Porcine rep roductive and resp i rat-ory syndro m e virus[J].VetM icrob i ol,1997,54:101-112.[3] STORGAARD T ,OLEKS I E W I CZ M ,BOTNER A.Exa m i nati on of
the selective p ressures on a li ve PRRS vacci ne vi ru s[J ].A rch V i ro l,1999,144:2389-2401.
[4] CANCEL -T I RADO S M,EVANS R B ,YOON K J.M onocl on al
an ti body anal ys i s of Porci ne reprodu cti ve and resp i rat ory synd ro m e virus ep i top es associated w ith anti body -dependent enhan ce m ent and neu traliz ati on of virus i n f ecti on [J ].Vet I m muno l I mm uno patho,l 2004,102(3):249-262.
(009)
94
H eil ong ji ang A n i m al Science
and V eter i nary M ed i c i ne
12011
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
关于我们
投诉建议