监控预警2018年12月27日
1、介绍
（1）基本原理
MicroPulser电穿孔仪用于细菌、酵母和其他众多微生物的电击转化，转化时，高压电脉冲作用于悬浮在小体积高阻介质中的样品。本系统由一个脉冲发生器（pulse generator）模块、一个电击腔（shocking chamber）和一个装有电极的电击杯（cuvette）组成。样本放置于电击杯的电极之间。MicroPulser模块包含一个电容器，将电容器充电至高电压，然后模块将电容器中的电流放电到试管中的样品中。 Micro泥浆固液分离Pulser的电容放电电路产生具有指数衰减波形的电脉冲，如下图。当电容器放电至样品时，跨越电极的电压迅速上升至最大电压（or峰值电压，peak voltage；也称为初始电压，Vo），并随时间（t）减小，如下式：
其中τ=R·C，为时间常数，是脉冲长度的简便表达式。
R为电路电阻，单位为ohms（欧姆）。
C为电容，单位为microfarad（微法拉）。
根据方程1，τ是电压下降至峰值电压1/e（~37%）的时间。MicroPulser的内部电路被设计以使E.coli、酿酒酵母及其他许多微生物可以得到最佳电穿孔，最佳转化效率发生在大约5ms的时间常数内。这些电穿孔条件是通过使用10微法拉电容器和将600欧姆电阻与样品池并联以及将30欧姆电阻与样品池串联来实现的。
除时间常数外，电场强度是另一个决定转化效率的重要参数。电场强度E，是施加于电极间的电压，公式为：
其中，V为施加的电压，d为电极间的距离，单位为cm。电场强度和细胞的尺寸（size）决定了横贯每个细胞的电压降，正是电压降可能是电穿孔中电压效应的重要表现。
30欧姆串联电阻的目的是在发生电弧的情况下保护设备电路。在正常操作条件下，当样本在高电阻介质中，电阻不会影响施加在样本上的电压。但是，当样本的电阻较低时，电阻将极大地降低施加在样品上的电压。施加在样品上的电压的分压降（fractional drop）由下式得到：
四辊冷轧机
当Rsample为600欧姆，对于样品就会有5%的电压降（30/（30+600）=0.048）。基于这个原因，当样品溶液的电阻低于600欧姆时，不应进行电穿孔试验。这包括培养基未彻底从细胞中去除的样本，残留有NaCl的DNA样本或连接混合物。MicroPulser能够测量样本的电阻，若样本介质电阻过低则不会进行操作。
（2）仪器参数操作（Manipulation of instrument parameters）
MicroPulser仪器的一些参数可以进行设置以达到最大转化效率，包括场强E，时间常数τ，
截断指数衰减脉冲的宽度。场强的设置可以有两种方式进行操作。一是，介于200-3000V电压可以直接在仪器上设置，这是最容易控制的。改变电压而保持其他条件不变是大多数电穿孔优化程序的基础。第二，使用不同电极间隙宽度的电转杯也是改变场强的一种方法。对于微生物的电穿孔，0.1和0.2cm间隙的电转杯最常被使用。E.coli的电穿孔当使用0.1cm电转杯时通常使用1.8kV电压（E=18kV/cm），而使用0.2cm电转杯时使用2.5kV电压（E=12.5kV/cm）。这些电穿孔条件作为预设程序内置于MicroPulser中，分别位于细菌设置菜单中的Ec1（V=1.8kV）和Ec2（V=勾花网机2.5kV）。另外，细菌设备菜单中的第三个程序Ec3的电压为3.0kV（当电转杯为0.2cm时E=15kV/cm），我们发现可以得到比2.5kV更高的转化效率。
时间常数可以通过改变样品的电阻而改变。样品电阻的改变可以通过两种方式。一是，增加电穿孔介质的盐浓度或缓冲浓度会降低样品的电导，反之亦然，结果导致时间常数的改变。第二，电转杯中样品体积与样品电阻呈反比，降低样品体积会增加样品电导。样品体积对电导的影响在低电阻介质中是最显著的。这些影响因素将会在后面部分进一步介绍。
MicroPulser还包括一种在电压大于600V时比预期时间常数更快截断指数衰减脉冲的方法。
当脉冲被MicroPulser终止时，电压只在样品上作用指定长度的时间，可能在1.0 ~ 4.0 ms之间。下图显示了这种波形和真正的指数衰减脉冲的差异。
2、影响电穿孔的因素
通过多年的研究，证实了微生物电穿孔的电条件（see Chang, et al., 1992, and Nickoloff, 1995, for overviews as well as for protocols on electroporation of numerous species）。对大多数微生物而言，最佳电转化发生在与E.coli和酿酒酵母所使用的电转化条件相似的条件下，E.coli和酿酒酵母是当今研究中最常使用的两个物种。对于E.coli的电穿孔，文献报道最常使用的条件是0.2cm电转杯，40μl细胞样本，电压2.5kV，时间~5ms。对酿酒酵母，报告中最常使用的条件是0.2cm电转杯，40μl细胞样品，1.5kV电压和时间常数~5ms。对许多细菌而言，如沙门氏菌属（Salmonella）、假单胞菌属（Pseudomonas托玛琳活水杯）、幽门螺杆菌（Helicobacter）、包柔式螺旋体属（Borrelia）、链球菌属（Streptococcus）、乳球菌属（Lactococcus）和肠球菌属（Enterococcus），电穿孔条件与E.coli一样。而对于其他的细菌，改变电场强度可以得到更高的电转化效率。一个相似的案例可见于其他种属的酵母。
MicroPulser的设计可以精确施加E.coli和酿酒酵母获得最佳转化效率所需的脉冲参数。当使用高阻样本时，时间常数被设置为5ms。对于这些微生物，MicroPulser预先设定了在0.1
或0.2 cm的电击杯中电穿孔大肠杆菌，或在0.2或0.4 cm的电击杯中电穿孔酿酒酵母时输送正确电压的程序。
（1） 细胞生长（Cell Growth）
对于大多数细菌而言，在对数生长期的早期或中期收获细胞，可以得到最高的转化效率。对于E.coli，当细胞进行稳定期，转化效率剧烈下降（Dower，1990）。相反，大多数酵母通常在对数生长的中期至晚期收获细胞。对于酿酒酵母（S.cerevisiae），对数生长晚期的培养物相比早期的培养物，转化效率提高了60倍（Becker and Guarente，1991）。获取细胞的最佳生长期通常随细胞种类而异。当制备一种新的物种的感受态细胞时，最好使用为同种属而制定的程序。对所需考虑因素的建议和常用的制备感受态细胞的方法在Dower et al（1992）和Trevors et al（1992）的文章中被详细讨论。
（2） DNA
大多数的电穿孔应用是将质粒DNA转入细胞中，需要提及的是，几乎任何形式的分子都可以通过电穿孔被导入细胞中，包括DNA、蛋白、糖类、小分子等。除了少数例外，当导入 自主复制质粒时，使用超螺旋质粒进行电穿孔可以提高转化效率。但是，将整合入宿主基因组的质粒当使用线性化质粒时，转化效率较高。例如，假丝酵母、毕赤酵母和四膜虫使用线性质粒比超螺旋质粒效率更高。
在E.coli和单核细胞增多性李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）电穿孔转化时，使用松弛型环状质粒（relaxed circular plasmid）仅比使用超螺旋质粒的转化效率略低（Leonardo and Sedivy，1990，Park and Stewart，1990）。但是，在E.coli和Streptococcus pyogenes（酿脓链球菌）的电穿孔转化时，线性质粒比环状质粒的转化效率低103-104倍（Shigekawa and Dower, 1988, Simon and Ferretti, 1991）。在大多数物种中，每mol数量的质粒的电穿孔效率随着质粒大小的增加而降低，包括E. coli （Leonardo and Sedivy, 1990, Siguret et al., 1994），Pseudomonas aeruginosa（假单胞菌属）（Dennis and Sokol, 1995），和Streptococcus thermophilus（嗜热链球菌属）（Somkuti and Steinberg，1988）。但是，有些物种，包括Lactococcus lactis（乳球菌属）（Holo and Nes，1995），Enterococcus faecalis（肠球菌属）（Cruz-Rodz and Gilmore，1990）和Clostridium perfringens（产气荚膜梭菌）（Allen and Blaschek，1990），转化效率似乎与质粒大小（即使高达20交换机面板-30Kb）无关。
尽管微生物的转化使用各种方法提取的质粒都可以完成，但质粒的纯度是影响转化效率的一个因素。未纯化的小量制备的质粒DNA的转化效率明显低于经过各种方法纯化的质粒DNA。利用Bio-Rad Quantum matrix制备的质粒与CsCl纯化质粒转化效率相当。
通常，对于所有种类的微生物，转化频率随着DNA浓度的增加而增加。对于E.coli，转化频率（转化子/活细胞）受DNA浓度影响的范围在106（10 pg/ml to 7.5 µg/ml），在这个范围内，DNA浓度决定了细胞被转化的概率。在较高的DNA浓度，高达80%的活细胞可被转化（Dower et al，1988）。因为获得的转化子的数量是转化频率和细胞数量的产物，转化效率（转化子/ug DNA）在109-3×1010细胞/ml范围内随细胞浓度增加而增加。因此，为了获得高的转化频率（transformation frequency），请使用高的DNA浓度。为了获得高的转化效率（transformation efficiency），请使用高的细胞浓度（和低的DNA浓度以防止共转化cotransformation）。在每个实例中，小的样本体积（20-50μl）允许经济地使用DNA和细胞（see Dower et al., 1988, for a detailed discussion of these factors）。
（3） 电穿孔介质（Electroporation Media）
MicroPulser被设计以使用具有高阻介质的样本。基于此，当制备感受态细胞时，洗涤以彻底去除培养基是非常重要的。若未彻底去除细胞中的培养基将导致电穿孔时在样本中产生电弧。细胞应该用水或低离子强度的溶液如蔗糖、甘油、葡萄糖、山梨醇或PEG洗涤至少3次。对许多微生物而言，甘油是一种方便的电穿孔介质，因甘油通常被用于细胞保存的冷冻保存液。
下图展示了几种不同生物学上的重要离子溶液对样品电阻的浓度效应。注意几点：
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