文献综述
磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶综述
[摘 要] 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶( PEPC)广泛存在于高等植物、藻类及大多数细菌中, 催化C4光合作用固定CO2的第一步反应。在过去的10年中关于 PEPC分子的一级结构研究已取得显著的进展, 最近, 通过X- 射线衍射分析阐明了大肠杆菌和米C4型PEPC分子的三维结构, 就这些研究进展进行总结。 关键词: 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 大肠杆菌 PEPC 玉米 C4型 PEPC 分子结构
一、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的分子结构[1]
彩钢板机房
PEPC (EC4.1.1.31)以 Mg2+或 Mn2+为辅助因子,催化磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)和HCO3-生成草酰乙酸( OAA)和无机磷酸的不可逆性反应。PEPC广泛存在于光合生物, 如植物、藻类、蓝细菌和光合细菌中, 还存在于很多非光合细菌和原生动物中。PEPC催化的反应为细胞各种组分的生物合成提供四碳二羧酸, 参与维持柠檬酸循环摩托车消音器, 在初级代谢中有重要的补给作用, 在C4植物和CAM 植物的光合作用中催化大气中CO2固定的第一步反应, 是C4光合作用途径中最重 要的酶之一。所有已知的PEPC均是四聚体,四个相同亚基的分子量大约为95~110k Da。大多数 PEPC是变构酶, 其活性调控方式为变构作用。不同种类生物的PEPC有多种变构效应物。把C4光合作用特异性的PEPC基因导入C3植物中,以期提高C3光合作用效率, 是目前植物基因工程的一个研究热点。研究结果发现在转基因植物中PEPC的活性也如同在C4植物中一样, 受代谢产物如苹果酸, 6-磷酸葡萄糖(Gluc6-P)和可逆性磷酸化的共价修饰调控。由于PEPC的变构调控方式和机理很 复杂,使PEPC的转基因操作得不到预期的结果, 为此PEPC的分子特性需要通过基因工程改造使之更适合转基因操作的要求。对PEPC分子结构的研究可以为基因工程改造PEPC的分子特性提供理论依据、为提高C3光合作用固定CO2的效率和作物的产量提供有益的启示。由于PEPC在生理学上的重要性,对PEPC酶学 特性的研究很多,在过去的10年里关于PEPC的一级结构和调控特性方面的研究 已取得极显著的进展, 最近由于 PEPC 蛋白质晶体制备技术的改进,获得高分辨率的大肠杆菌PEPC( Ec PEPC)和玉米 C4型PEPC( Zm PEPC蛋白质的晶体, 通过X-射线射分析PEPC蛋白质晶体结阐明了Ec PEPC和Zm PEPC的三维结构, 着重介绍 PEPC分子的一级结构和三维结构方面研究的最新进展。 尾气抽排系统二、磷酸烯醇式丙酮酸竣化酶的光调节[2]
1、PEP竣化酶光活化测定条件及光活化现象
1.1 IC;植物PEP梭化酶的光活化
Rogiel等川以玉米为材料发现从光暗两种处理叶片中提取PEP梭化酶的饱和动力学曲线有所不同,光下比暗中酶活性高,推测玉米叶片中可能存在两种PEP梭化酶,一种在光下占优势,简称光型PEP梭化酶,一种在暗中占优势,简称暗型PEP梭化酶。几乎同时,Huber等囚同样以玉米为材料,也观测到了PEP梭化酶的光活化现象,并发现光暗两型PEP梭化酶活性间的差异与效应剂存在与否有关。无效应剂存在时,光型酶是暗型酶活性的2倍,当只加入苹果酸(Mal)或加入Mal后再加入6一磷酸葡萄糖(G一6一)P时,光型酶是暗型酶活性的20倍左右;对PEP梭化酶蛋白含量进行测定发现光、暗两种处理酶蛋白含量并无明显差异,表明光暗转化过程中酶活性的变化是一个转译后的调节过程。
2、PEP羚化酶光活化的机理
1、氧化还原的调节
2、晦蛋白的碑酸化和脱磷酸化
3、酶分子聚合态之间相互变化
4、光合细胞中代谢水平的变化
3、PEP狡化酶的光诱导形成
光可以诱导PEP梭化酶的合成,光敏素作为光受体参与了这一过程,但从光敏素接受光信号到PEP梭化酶基因表达之间的光信号转导过程还不了解。Roux等c24〕提出钙信使系统参与光敏素信号转导的假说,这一假说已在红光诱导的球子族抱子萌发c25,、红光诱导的转板藻叶绿体转动〔26)、红光诱导的小麦原生质体膨大卿〕以及光敏素调节的蕃茄叶绿体发育〔翔等过程中得到不同程度地证实。最近也证实钙信使系统可能参与了光敏素调节的尾穗览觅红素的合成。然而,最近的研究结果表明cGMP信使系统参与了蕃茄细胞中光敏素调节的花素昔的合成,而。GMP和钙信使系统共同参与了光系统I(P51)和细胞素bJ复合体(Cytbof)的合成,并且G一蛋白(GTP结合调节蛋白)在光受体和胞内信使之间起偶联作用。
三、乙酸化修饰调控代谢网络和户的机制的研究[3]
1、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶
HATs的功能是将乙酞基从乙酞一转移到组蛋白一末端尾部特定的。氨基上,部分中和组蛋白尾部的正电荷,使与组蛋白间的静电引力和空间位阻增大,两者之间的相互作用减弱,易于解聚,染质呈转录活性结构,因此有利于转录因子与模板相结合,进而激活基因转录。日可作为辅激活因子调控转录、调节细胞周期、参与损伤修复。
自从Kleff等第一次发现乙酞化转移酶Hat1以来,乙酞基转移酶受到越来越多的关注。乙酞基转移酶在进化上,从酵母到人类都是保守的,并且形成了多个亚单位的复合体。但与去乙酞化转移酶不同的是,乙酞基转移酶结构和功能更多样化,分类也更加复杂。他们总的可以分为两类：A型和B型。A型乙酞基转移酶主要在转录中起作用,又分为个5个家族,p300/CBP,MYST,GNAT,一般转录因子和核受体辅助因子等。核内的A型的乙酞基转移酶大部分相当保守,与其他分子形成高分子量的复合体。细胞浆内的B型的乙酞基转移酶对从头合成的游离的组蛋白进行乙酞化修饰,促进组蛋白入核,与新合成的DNA结合在一起。许多乙酞基转移酶表现出了明显的底物特异性,即使是对于组蛋白。乙酞基转移酶复合体也影响染体的包装,DNA损伤的修复和非组蛋白底物的乙酞化。许多乙酞基转移酶拥有一个进
化上保守的结构域一。结构域,它可以识别乙酞化的赖氨酸,通过染质相关蛋白去乙酞化组蛋白。
2、磷酸烯醇式丙酮酸梭激酶的泛素化研究
2.1构建稳定表达PEPCK1的细胞株
①克隆
②转染293T细胞
③感染
④筛选
2.2特异敲落UBR5,P300,Sirt2的寡核昔酸链
寡核昔酸链序列通过网络上合成。原则上,序列应符合以下标准
1 GC含量为36-62％
2 最好是的模式AAN19dTdT的模式
3 排除连续4个A或4个T的序列
⑷通过Blast检验,不会影响其他基因的表达。
四、植物磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的功能及其在基因工程中的应用[4]
植物磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(Phosphoenolpyruvate carboxylase，PEPC，EC 4.1.1.31)是广泛存在的一种细胞质酶，催化磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)和HCO3-生成草酰乙酸 (OAA)，后者可转化生成三羧酸循环的多种中间产物。PEPC在植物细胞中参与植物的光合碳同化等重要代谢途径，并且在不同组织中具有多种生理功能。PEPC 同时也参与调控植物种子的营养物质合成与代谢过程，控制糖类物质流向脂肪酸合成或蛋白质合成途径。以下介绍了植物 PEPC的种类、蛋白质结构特点及其在植物组织中的调控方式，并重点论述了 PEPC 在生物基因工程中的应用方面的进展，随着对其功能机制和应用研究的深入，将有助于植物PEPC在高产优质农作物育种、能源植物和工业微生物等的开发利用等方面得到更好的发展与应用。
1、植物 PEPC 的种类与结构
1.1 植物 PEPC 的种类和基因序列特征
PEPC 多肽段的大小变化非常大，在高等植物中，PEPC 主要以4捕虾机电路图种同工酶形式存在，即C4光合型、C3光合型、CAM型以及非光合型。在大多数高等植物中存在着 3~4 个编码PEPC的小 ppc 基因家族，每个家族包含 1 个到多个基因。
1.2 PEPC 的蛋白质结构
目前所有已知的 PEPC 均是四聚体，4 个相同亚基的分量范围95~110k Da。2002 年Matsumura 等发表了从玉米叶片中纯化的结合了硫酸根离子的Zm PEPC蛋白质晶体结构，这是目前唯一报道的植物 PEPC 的三维蛋白晶体结构。X-衍射分析发现 Zm PEPC 酶蛋白由 4 个相同的亚基组成“双二聚体”构型，排列成四方形，中间是 1 个大空隙。
2、植物组织中 PEPC 的活性调节
绝大多数的 PEPC 是变构酶，其变构作用的调节过程往往与代谢产物的反馈调节作用相关。双子叶植物 PEPC 的活性可被正调控代谢效应物葡萄
糖-6-磷酸 (G-6-P)和丙糖磷酸等激活，并被负调控反馈抑制剂L-苹果酸或Asp等抑制，同时单子叶植物 PEPC 活性还可被 Gly 或 Ala 激活。另外，一些包含磷酸基的化合物以及有机酸或 PEP/丙酮酸的类似物还分别是常用的激活剂和抑制剂。除此之外，C4植物PEPC 氨基端的1个保守丝氨酸残基还受到可逆磷酸化的调节。
3、PEPC在基因工程中的应用
3.1 提高作物光合效率
熏蒸桶 C4 PEPC 对其底物 HCO3-有较高的亲合力，将麦克力电气C4光合关键酶基因导入C3植物从而在重要的C3作物中建立起C4循环，提高光合生产能力一直是人们关注的问题。
3.2 提高油料作物种子脂肪酸含量
PEPC 是控制植物种子中蛋白质和脂肪酸合成的关键酶之一，抑制其活性可以提高植物体中脂肪酸的含量。PEPC在植物种子中参与种子贮藏蛋白和脂肪酸代谢的调控方面的功能引起了农业界的关注，当PEPC 的表达受到抑制时， PEPC通过改变代谢模式使碳原子的流向从糖类物质的合成转
向脂肪酸的合成。
3.3促进种子蛋白质合成
在种子中，与抑制 PEPC 表达促进脂肪酸的合成相反，提高 PEPC 的表达可激活糖酵解过程中碳原子流向蛋白质方向的分支代谢途径。在种子发育的早期和中期，子叶中 PEPC 的表达量会明显上升，它的活性通常被磷酸化所激活，并受到植物此时碳源和氮源供给的影响，种子发育后期蛋白质合成基本完成后 PEPC 的活性明显下降，因而从一个侧面反映了发育子叶中 PEPC对于蛋白合成当中通过合成有机酸为氨基酸提供碳骨架的重要性。
3.4 在微生物和藻类基因工程中的应用
PEPC 在种类繁多的微生物中也广泛分布，并具有多重生物功能，是糖异生作用和氨基酸合成之间的重要纽带，因此也是许多微生物基因工程的调
控靶标。
五、结语
磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(Phosphoenolpyruvate carboxylase，PEPC，EC是广泛存在的一种细胞质酶，催化磷酸烯醇式丙酮酸 (PEP)和HCO3-生成草酰乙酸 (OAA)，后者可转化生成三羧酸循环的多种中间产物。PEPC 在植物细胞中参与植物的光合碳同化等重要代谢途径，并且在不同组织中具有多种生理功能。PEPC 同时也参与调控植物种子的营养物质合成与代谢过程，控制糖类物质流向脂肪酸合成或蛋白质合成途径。以下介绍了植物 PEPC的种类、蛋白质结构特点及其在植物组织中的调控方式，并重点论述了 PEPC 在生物基因工程中的应用方面的进展，随着对其功能机制和应用研究的深入，将有助于植物 PEPC 在高产优质农作物育种、能源植物和工业微生物等的开发利用等方面得到更好的发展与应用
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