一、实验原理
细胞骨架（cytoskeleton）是真核细胞中由纤维蛋白所组成的网状结构，对细胞形态的维持，细胞的生长、运动、分裂、分化，物质运输，能量转换、信息传递，基因表达等起到重要的作用。广义的细胞骨架包括细胞质骨架、细胞膜骨架、细胞核骨架、细胞外基质四类，而狭义的细胞骨架指的就是细胞质骨架。根据其组成成分和形态结构，细胞质骨架可分为微管（microtube）、微丝(microfilament)和中间纤维(intermediate filament)。目前观察细胞骨架的手段主要有电镜、间接免疫荧光技术、酶标和组织化学等。 微丝是球形肌动蛋白单体（G-actin）构成的纤维(F-actin)结构，单根微丝直径7nm，在光学显微镜下看不到该细胞骨架的结构。常用的观察微丝的方法主要有两种：罗丹明标记的鬼笔环肽染法和考马斯亮蓝R-250染法。
鬼笔环肽是一种从毒蕈中提取的双环杆肽，分子量小，容易进入细胞，能与微丝强烈结合，结合在微丝的亚单位之间，具稳定微丝和促进微丝聚合的作用。由于鬼笔环肽分子量很小，即使加上荧光标记，也能很容易的进入细胞。又由于它只与F-actin(F肌动蛋白; 纤维状肌动蛋白)结合而不与G-actin(G-肌动蛋白，球状肌动蛋白)结合，所以，用荧光标记的鬼笔环肽对细胞进行染，可以很清晰地看到微丝（是双
股肌动蛋白丝以螺旋的形式组成的纤维）的图象，微丝呈明亮的橘红。
速冻生胚包子考马斯亮蓝是一种蛋白质染料，主要有R-250和G-250两种类型。考马斯亮蓝可以和蛋白肽链中碱性氨基酸残基（Arg）或芳香族氨基酸残基结合，使蛋白变蓝。由于反应时颜的深浅与蛋白的含量相关，所以可依此进行蛋白浓度的测定。考马斯亮蓝主要用于对蛋白含量的测定和对蛋白进行染观察，在蛋白的定量分析、蛋白的电泳和细胞骨架观察中有非常重要的应用。由于考马斯亮蓝R-250并非微丝专一性的染料，所以，在用它对微丝进行染观察前，应首先用去垢剂抽提掉胞质中的除骨架以外的其他蛋白，以便清晰地显示细胞质中微丝的结构。
本实验观察的是植物细胞中由微丝平行排列形成的微丝束，在动物细胞中称为“应力纤维”。非肌细胞中的微丝是动态结构，单体和纤维在一定的条件下可相互转化。本实验中M －缓冲液提供的离子条件可使纤维稳定。在Mg2+、高浓度K+、Na+诱导的条件下，F-actin 趋于稳定，而在含A TP、Ca2+和低K+、Na+的条件下，F-actin趋于解聚。EDTA（乙二胺四乙酸二钠）可螯合大部分金属离子；EGTA（乙二醇双醚四乙酸）可专一性螯合Ca2＋，因此加入EGTA来降低Ca2＋的浓度，维持微丝的稳定性。
为了更好地观察微丝束的结构，采用了戊二醛对细胞进行固定。戊二醛是一种双交联剂，渗透快，交联能力强，对蛋白质的固定效果好，且不破坏细胞骨架的结构。
去垢剂为一端亲水一端疏水的小分子，可将膜脂包围在内部，从而形成水溶性的分子，导致细胞膜系统的崩解，是分离与研究膜蛋白的常用试剂，可分为离子型去垢剂和非离子型去垢剂两类。常用的离子型去垢剂有十二烷基磺酸钠SDS，能破坏蛋白质分子中的氢键和疏水键，使蛋白多肽链展开，SDS则以其烃链与蛋白分子侧链结合。SDS作用剧烈，能引起蛋白的变性。TritonX-100（曲拉通X-100，液体）又名聚乙二醇辛基苯醚，是一种非离子型去垢剂，作用温和，是研究细胞骨架蛋白的重要的工具药物。当用适当浓度的TritonX-100处理植物细胞后，可使细胞质膜中和细胞质中的蛋白质（能使95%以上的可溶性蛋白被抽提）和全部脂质被溶解抽提，而细胞骨架系统的蛋白质却保存完好，经考马斯亮蓝R-250染，在光学显微镜下可观察到由微丝组成的微丝束为网状结构。
二、实验目的
掌握用光学显微镜观察植物细胞骨架的原理和方法，观察光学显微镜下植物细胞骨架的网状结构。
三、实验材料
洋葱鳞片（叶）。
四、实验试剂配制
智慧交通管理1. 0.2%考马斯亮蓝R250染液：称考马斯亮蓝R250 1g，溶于250mL无水乙醇中，加冰醋酸35mL，
再加蒸馏水至500mL。
2. 磷酸缓冲液（PH6.8）：6.8mmol/L磷酸缓冲液，调至PH6.8。
3. M缓冲液（PH7.2）：50mmol/L咪唑、50mmol/L氯化钾、0.5mmol/L氯化镁、1mmol/L 乙醇双乙胺醚、0.1mmol/L乙二胺四乙酸、1mmol/L巯基乙醇，调至PH7.2。
4. 1%Trion X-100：用M缓冲液配制。
5. 3%戊二醛：用M缓冲液配制。
五、实验前的准备
主要仪器：普通显微镜（25台/班，1台/组）。
恶劣的太阳
辅助仪器：镊子（25把/班，1把/组）；50mL三角瓶（25个/班，1个/组）；载玻片、盖玻片（各50片/班，各2片/组）。
耗材：擦镜纸、吸水纸（各25包/班，各1包/组）。
材料：洋葱鳞片（叶）（25头/班，1头/组）
药品试剂：0.2%考马斯亮蓝R250染液（500mL/班，20mL/组）；磷酸缓冲液PH6.8（2000mL/班，80mL/组）；M缓冲液PH7.2（1500mL/班，60mL/组）；1%TrionX-100（500mL/班，20mL/组）；3%戊二醛（500mL/班，20mL/组）。
备注：0.2%考马斯亮蓝R250染液：称考马斯亮蓝R250 1g，溶于250mL无水乙醇中，加冰醋酸35mL，再加蒸馏水至500mL；磷酸缓冲液（PH6.8）：6.8mmol/L磷酸缓冲液，调至PH6.8；M缓冲液（PH7.2）：50mmol/L咪唑、50mmol/L氯化钾、0.5mmol/L氯化镁、1mmol/L 乙醇双乙胺醚、0.1mmol/L乙二胺四乙酸、1mmol/L巯基乙醇，调至PH7.2；1%Trion X-100：用M缓冲液配制；3%戊二醛：用M缓冲液配制。
六、实验步骤
1. 用镊子撕取洋葱鳞叶内侧的表皮若干片（约1cm2大小若干片），置于50mL烧杯中，加入pH6.8磷酸缓冲液（5mL左右），使其下沉（10min左右）。
2. 吸去磷酸缓冲液，用1%Trion X-100（5mL左右）处理20min。
3. 吸去Trion X-100，用M缓冲液（5mL左右）洗3次，每次5min。
4. 用3%戊二醛（5mL左右）固定30min。
5. 磷酸缓冲液（PH
木纤维袜子6.8）（5mL左右）洗3次，每次5min。
6. 0.2%考马斯亮蓝R250（5mL左右）染10min。
7. 蒸馏水洗2次，然后将样品置于载玻片上，加盖玻片，在普通光学显微镜下观察。
七、结果
猪食槽在细胞中可以观察到染成兰的呈网状的细胞骨架（如下图所示）。
图1 洋葱内表皮细胞骨架
聚酯线绳八、注意事项
1. 对材料处理过程中，要不定时的轻轻摇动烧杯。
2. 样品要展平置于载玻片上，然后进行观察。
九、回答问题
1．描绘所观察到的植物细胞的骨架图
答：略。
2．什么是细胞骨架？它有何主要功能？
答：细胞骨架（cytoskeleton）是真核细胞中由纤维蛋白所组成的网状结构，对细胞形态的维持，细胞的生长、运动、分裂、分化，物质运输，能量转换、信息传递，基因表达等起到重要的作用。
3．说明实验中使用的TritonX-100、戊二醛、考马斯亮蓝R-250的作用。
答：（1）TritonX-100又名聚乙二醇辛基苯醚，是一种非离子型去垢剂，作用温和，是研究细胞骨架蛋白的重要的工具药物。当用适当浓度的TritonX-100处理植物细胞后，可使细胞质膜中和细胞质中的蛋白质（能使95%以上的可溶性蛋白被抽提）和全部脂质被溶解抽提，而细胞骨架系统的蛋白质却保存完好；（2）戊二醛是一种双交联剂，渗透快，交联能力强，对蛋白质的固定效果好，且不破坏细胞骨架的结构；（3）考马斯亮蓝是一种蛋白质染料，主要有R-250和G-250两种类型。考马斯亮蓝可以和蛋白肽链中碱性氨基酸残基（Arg）或芳香族氨基酸残基结合，使蛋白变蓝。
十、建议课时安排
该实验全部完成的时间为120min左右，建议课时安排3个。
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