具有独脚金内酯活性的肉桂酰胺内酯类化合物及其制备与应用

1.本发明属于植物生长调节剂领域，具体涉及具有独脚金内酯活性的肉桂酰胺内酯类化合物及其制备与应用。

背景技术：

2.植物生长调节剂在农业生产上被广泛使用，能有效调节作物的生育过程，达到稳产增产、改善品质、增强作物抗逆性等目的。独脚金内酯(strigolactones，sls)是近年来备受关注的一类新型的内源性植物激素，sls存在于许多植物中，特别是在根系分泌物中。首个sls是1966年从棉花的根系分泌物中分离出来的一类类胡萝卜素类萜类内酯小分子。在不同的植物物种中已经发现的独脚金内酯主要分为典型的和非典型的两类化合物，典型的sls由丁烯内酯环(d环)通过烯醇醚桥连接到三环内酯(abc环)，非典型的sls中abc环被不规则的环结构取代。
3.作为一类天然存在的植物信号分子，不同结构的独脚金内酯分子可能表现出不同的生物活性。sls调控根和地上部的协调发育如枝条分枝/分蘖和枝条二次生长，决定初生根、侧根、树冠和不定根、根毛密度形成。此外，sls还调控叶片衰老和根结瘤，参与病原菌防御和非生物胁迫反应。sls作为根际信号分子诱导寄生植物的种子萌发，通过刺激丛枝菌根真菌的菌丝分枝，与丛枝菌根真菌建立有益的共生关系。
4.天然sls在植物体内含量极低、结构复杂、人工合成成本高，无法实现大规模制备，因而设计合成高活性且结构简单的sls类似物是当下研究的热点。目前，应用最广泛和有效的类似物是gr24，但由于合成步骤繁琐产率低导致生产成本高，限制了其大规模推广和使用。因此设计简单、廉价、效率合理的独脚金内酯功能类似物很重要。

技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种具有独脚金内酯活性的肉桂酰胺内酯类化合物及其制备与应用，本发明的肉桂酰胺内酯类化合物在植物生长调节方面具有重要的作用，可以作为植物生长调节剂在农业上应用。
6.本发明所提供的肉桂酰胺内酯类化合物，其结构式如式i所示：
[0007][0008]
式i中，
[0009]
r表示苯环上的取代基，可选自氢、卤素、硝基、氰基、c1～c4直链或支链烷基、c1～c4烷氧基、卤素取代的c1～c4烷基、酰基(具体可为甲酰基-cho)、芳杂基、杂环基、羧基、或
与苯环稠合的芳杂基、杂环基中的至少一种；
[0010]
所述式i中，r优选为氢、2-氟、3-氟、4-氟、2-氯、3-氯、4-氯、2-溴、3-溴、4-溴、2-甲基、3-甲基、4-甲基、2-甲氧基、3-甲氧基、4-甲氧基、3,4-二氯、2,5-二氯、h、3,4-亚甲二氧基中的至少一种。
[0011]
具体的，所述式i所示化合物为如下化合物中的任意一种：
[0012][0013]
本发明还提供上述式i所示化合物的制备方法。
[0014]
本发明所提供的上述式i所示化合物的制备方法，包括如下步骤：
[0015][0016]
使得式ii所示化合物与式iii所示化合物在缩合试剂存在下进行酯化缩合反应，得到式ⅰ所示化合物；
[0017]
式ii中r与式i中r相同；
[0018]
上述的制备方法中所述缩合试剂为dic、diea、dcc、dmap、edci和hobt中的至少一种；
[0019]
上述的制备方法中所述酯化缩合反应在-10～60℃下进行，优选反应温度为室温，反应时间可为2-24h，优选反应时间可为12小时、4～8小时、8～12小时；
[0020]
所述式ii所示化合物和所述式iii所示化合物的摩尔比可为1:0.8～10，具体可为1:1.2～10。
[0021]
上述的制备方法中，所述酯化缩合反应在有机溶剂中进行，
[0022]
所述有机溶剂选自环己烷、己烷、四氢呋喃、二氯甲烷、1,4-二氧六环、乙酸乙酯、甲醇、乙醇、正丙醇、四氯化碳、dmf、氯仿、二乙醚、乙腈中的至少一种或两种及以上的任意组合；
[0023]
本发明中，式ⅱ所示化合物按如下路线制备：
[0024][0025]
式(1)、式(3)中r与式i中r相同；
[0026]
其制备方法包括如下步骤：
[0027]
1)式(1)所示取代肉桂酸和式(2)所示甘氨酸乙酯盐酸盐、hobt、edci、三乙胺于有机溶剂中混合，反应，得到式(3)所示化合物；
[0028]
2)式(3)所示化合物在含无机碱的有机溶剂中水解，反应结束将混合物浓缩后投入到冰水中，用稀盐酸调节ph至3-4，抽滤，滤饼即为式(ii)所示化合物；
[0029]
上述方法步骤1)中，取代肉硅酸与甘氨酸乙酯盐酸盐的摩尔比为1:1～3，
[0030]
所述反应的温度可为20-30℃，具体可为25℃；
[0031]
所述有机溶剂为二氯甲烷、dmf、thf中的一种；
[0032]
上述方法步骤2)中，所述水解的温度可为0～30℃，时间可为2～16h；
[0033]
所述无机碱为氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化锂中的一种或多种；
[0034]
所述有机溶剂为甲醇、乙醇、氯仿、二乙醚、乙腈中的一种或多种。
[0035]
本发明中，式ⅱi所示化合物可以直接购买或者按如下路线制备：
[0036][0037]
其制备方法包括如下步骤：
[0038]
式(4)所示化合物和式(5)所示化合物在有水溶液中硫酸催化下发生环化反应得到式iii所示化合物。
[0039]
其中式(4)所示化合物和式(5)所示化合物的摩尔比可为：1：1.0-2.0；
[0040]
式(4)所示化合物与浓硫酸摩尔比可为：1：0.01％-0.1％；所述环化反应的时间可为12-24h。
[0041]
上述式i所示化合物作为植物生长调节剂在下述方面的应用也属于本发明的保护范围：
[0042]
1)促进寄生杂草种子萌发；
[0043]
2)抑制植物幼苗下胚轴的伸长；
[0044]
3)促进植物的根毛生长；
[0045]
4)抑制植物的侧根生成；
[0046]
5)抑制植物的分枝发育；
[0047]
6)促进植物叶片的衰老；
[0048]
7)促进从枝菌根真菌菌丝的生长。
[0049]
所述植物具体可为拟南芥、水稻、小麦。
[0050]
所述寄生杂草具体可为列当、独脚金。
[0051]
具体地，所述应用为式i所示化合物在如下方面的应用：
[0052]
1)促进列当种子萌发；
[0053]
2)抑制拟南芥下胚轴伸长、抑制拟南芥主根生长、抑制拟南芥侧根产生；
[0054]
3)抑制水稻分蘖。
[0055]
本发明还提供一种植物生长调节剂，所述植物生长调节剂含有上述式i所示化合物。
[0056]
本发明提供了一种结构简单、合成便捷、生物活性高的独脚金内酯类似物，同时对该类化合物进行瓜列当种子萌发、拟南芥下胚轴伸长和根生长、水稻分蘖测试，结果显示该类化合物对列当具有较好的种子萌发活性，对拟南芥下胚轴伸长、侧根生长和水稻分蘖具有较好的抑制活性。该化合物易制备，低成本，农业应用推广价值高，值得后续的深入研究开发，是具有广阔应用前景的植物生长调节剂。
附图说明
[0057]
图1为本发明实施例1中制备化合物ii-04的合成路线图。
具体实施方式
[0058]
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
[0059]
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0060]
实施例1、化合物ii-04的制备
[0061]
按照图1所示的合成路线图制备化合物ii-04。
[0062]
具体反应步骤如下：
[0063]
在室温下，将甲基丙二酸(45.0克)加入到乙二醛(79.8克，40％w/w溶液)的水(400毫升)溶液中，随后加3ml浓h2so4，加热回流反应，18小时后，加适量nacl固体，随后用乙酸乙酯萃取，有机相经无水na2so4干燥，浓缩后经柱层析[v(石油醚)∶v(乙酸乙酯)＝5∶2]分离得
5-羟基-3-甲基-2-(5h)-呋喃酮黄固体1(21.3g,49％)。
[0064]
将2氯-肉桂酸(3.00g,16.48mmol)、hobt(3.34g,24.72mmol)和edci(4.76g,24.82mmol)加入到40ml二氯甲烷溶液中，常温反应1.5h，滴加甘氨酸乙酯盐酸盐(3.45g,24.72mmol)的二氯甲烷(50ml)混合体系，随后加三乙胺调节ph为中性，常温反应。薄层层析[tlc，v(石油醚)∶v(乙酸乙酯)＝3∶1]监测反应，12h后反应结束。反应体系用二氯甲烷萃取，有机相依次经饱和食盐水洗涤、无水硫酸钠干燥、过滤、减压浓缩后经柱层析分离得到白固体2(2.80g,63.61％)。
[0065]
将上述所得的白固体2(2.00g，7.49mmol)溶于30甲醇中，加几滴naoh(6mol/l)溶液,室温反应。薄层层析[tlc，v(石油醚)∶v(乙酸乙酯)＝1∶1]监测反应，12h后反应结束。浓缩反应体系，加少量水后用5％稀盐酸调ph为3-4，析出白固体，抽滤烘干得白固体3(1.60g,89.42％)。
[0066]
将上述得到的白固体3(1.00g，4.18mmol)、dcc(1.30g，6.27mmol)、dmap(0.2g，1.63mmol)加入到thf(30ml),反应15分钟后，将5-羟基-3-甲基-2-(5h)-呋喃酮(0.57g，5.02mmol)的thf溶液滴加到反应体系中，常温反应过夜。薄层层析[tlc，v(石油醚)∶v(乙酸乙酯)＝1∶1]监测反应，10h后反应完全。将反应体系抽滤，滤液用二氯甲烷和水萃取，有机相依次经饱和食盐水洗涤、无水硫酸钠干燥、过滤、减压浓缩后经柱层析分离得到白固体ii-04(0.90g,64.21％)。
[0067]
化合物ii-01～ii-19按照上述路线合成，化合物理化数据如表1所示，典型化合物的nmr数据如表2。
[0068]
表1式i部分化合物的外观和收率
[0069]
化合物r收率状态ii-012-f51％白固体ii-023-f46％白固体ii-034-f53％白固体ii-042-cl64％白固体ii-053-cl66％白固体ii-064-cl57％白固体ii-072-br41％白固体ii-083-br45％白固体ii-094-br50％白固体ii-102-ch339％白固体ii-113-ch344％白固体ii-124-ch347％白固体ii-132-och342％白固体ii-143-och352％白固体ii-154-och348％白固体ii-162,5-cl42％白固体ii-173,4-cl43％白固体ii-18h64％白固体
ii-193,4-亚甲氧基52％白固体
[0070]
表2式i部分化合物核磁共振数据
[0071][0072]
[0073]
[0074]
[0075]
[0076][0077]
实施例2、式i化合物进行瓜列当种子萌发活性测试，测试方法如下：
[0078]
瓜列当种子浸泡于75％的酒精2min进行表面消毒，之后用无菌蒸馏水冲洗干净。取一直径9cm的塑料培养皿，底层铺两张滤纸并用无菌蒸馏水润湿，而后铺满直径10mm的玻璃纤维滤纸片。将种子均匀洒在湿的玻璃纤维滤纸片上，种子数约30-80粒。用封口胶密封培养皿并于暗处25℃预培养种子3-7天。将预培养种子的玻璃纤维滤纸片置于塑料培养皿，并加入50μl待测化合物溶液，封口胶密封培养皿。将种子放至25℃恒温培养箱内培养7天，采用双目显微镜观察并统计列当种子的萌发率，当胚根出现时视为列当种子发芽，以商品化gr24为阳性对照，无菌蒸馏水为阴性对照。每个浓度化合物平行测试三次，各浓度化合物每次五组实验并计算均值及标准偏差，使用graphpad prism 8.0软件进行剂量-反应分析，结果以ec
50
(半最大效应浓度)表示，计算化合物的ec
50
值。式i化合物对瓜列当萌发活性数据见表3。
[0079]
表3式i化合物10-6
m浓度下对瓜列当种子的诱导萌发率
[0080]
化合物萌发率(％)化合物萌发率(％)gr2492.2ii-1025.9ii-0135.6ii-1125.0ii-0244.1ii-1212.1ii-0347.9ii-1339.0ii-0442.5ii-1414.6ii-0581.6ii-1529.7ii-0690.7ii-1636.2ii-0768.3ii-1725.4ii-0853.8ii-1839.4ii-0923.9ii-1930.1
[0081]
从表3可以看出，在10-6
m的药物浓度下，所有设计合成的化合物对瓜列当种子萌发均有促进作用。其中对瓜列当种子萌发促进活性最好的是化合物ii-06，萌发率达到了90.7％，和对照药物gr24(92.2％)的效果相当；其次是化合物ii-05，达到了81.6％，也能很好的促进瓜列当种子的萌发。结果显示由于化合物成本低廉，在同等情况下，新化合物在寄生杂草种子萌发剂的应用上具有很大的潜力。
[0082]
实施例3、哥伦比亚野生型拟南芥下胚轴伸长活性试验以及根生长情况试验
[0083]
野生型拟南芥种子(columbia-0,col-0)用1％次氯酸钠15min，无菌水洗净播种于
1/2ms(0.8％琼脂,1％蔗糖和指定浓度的化合物)；4℃冰箱春化3天，随后转移至人工气候箱黑暗条件下，22℃培养7天，整株拍照后，imagej软件测量其下胚轴长度。由公式：下胚轴伸长抑制率＝(空白组下胚轴长度一药物组下胚轴长度)/空白组下胚轴长度
×
100％，计算出各化合物及对照药物gr24对拟南芥下胚轴的伸长抑制率，所有化合物测试结果如表4所示。
[0084]
拟南芥种子用1％的次氯酸钠溶液消毒15min，无菌水洗净后播种于1/2ms培养基(0.8％琼脂，1％蔗糖和指定浓度的化合物)；4℃冰箱春化3天，随后转移至人工气候箱，光暗(16/8h，22/19℃)培养7天，整株拍照，image j软件测定拟南芥主根的长度，由公式：主根生长抑制率＝(空白组主根长-药物组主根长)/空白组主根长
×
100％，计算主根生长抑制率，如表5所示；并通过观察统计根数，如表6所示。
[0085]
表4式i化合物10um浓度下对拟南芥下胚轴伸长的抑制率
[0086]
化合物抑制率(％)化合物抑制率(％)gr2436.9ii-1018.6ii-011.6ii-116.8ii-02-3.0ii-124.9ii-03-1.7ii-13-2.8ii-04-2.5ii-14-4.4ii-0512.8ii-155.1ii-0612.0ii-168.0ii-075.4ii-171.0ii-088.9ii-183.4ii-0916.4ii-19-7.1
[0087]
从表4可以看出，本发明涉及的部分肉桂酰胺内酯类化合物对拟南芥下胚轴的生长具有一定的抑制作用，其中化合物ii-10的抑制效果较为明显达到18.6％，随着浓度的提高，药效可能会更好。
[0088]
表5式i部分化合物10um浓度下对拟南芥主根生长的抑制率
[0089]
化合物抑制率(％)化合物抑制率(％)gr2443.8ii-1017.1ii-0144.8ii-1136.9ii-0239.4ii-1240.1ii-0423.6ii-1323.4ii-0522.6ii-1517.4ii-0642.1ii-160.2ii-0735.0ii-1749.4ii-0841.5ii-1840.1ii-0913.5ii-1913.2
[0090]
表6拟南芥在10um浓度的式i部分化合物及对照药物处理下生根数量
[0091]
化合物侧根数(条)化合物侧根数(条)
ck1.9ii-100.7gr240.3ii-111.5ii-011.0ii-120.5ii-020.2ii-131.1ii-041.3ii-151.1ii-051.4ii-161.1ii-060.3ii-171.4ii-070.6ii-180.9ii-080.8ii-190.8ii-090.3
ꢀꢀ
[0092]
由表5、表6可以发现，本发明的肉桂酰胺类似物具有与独脚金内酯类似的功能，且活性较高，有的活性优于gr24。从表5可知在浓度为10um时，多个化合物对拟南芥主根的生长抑制效果与同浓度的gr24所能达到的效果相当，如化合物ii-01、ii-06、ii-08、ii-12、ii-18等。其中抑制主根生长活性最好的是化合物ii-17，抑制率达到了49.4％，相比于gr24其抑制效果更为明显。
[0093]
从表6可以看出化合物在抑制主根的同时，大部分化合物对侧根产生的抑制效果显而易见。抑制效果最好的化合物ii-02，侧根数为0.2，活性好于gr24(0.3)；其次是化合物ii-06与ii-09，抑制作用与gr24相当。表明化合物具有独脚金内酯相关活性，同时设计化合物成本低廉，在同等情况下具有很高的利用价值。
[0094]
实施例4、化合物对水稻分蘖的抑制作用
[0095]
水稻种子(日本晴)通过用1.5％次氯酸钠洗涤30分钟进行表面灭菌,然后用无菌的去离子水彻底冲洗种子，并在黑暗中于30℃水中培养2天。将预发芽的种子转移到90mm培养皿中的滤纸上，并在荧光白光(130
–
180μm2s-1
)下于30℃培养1周，16h光照8h黑暗。将7天龄的幼苗转移到含营养液的水培盒中，并在人工气候箱中生长。用式i化合物在2μm浓度下处理水稻，使用gr24作为阳性对照。这些化合物每周施用两次，共施用六次。在最终收获时测量每株分蘖数，所有化合物测试结果如表7所示。
[0096]
表7式i化合物对水稻分蘖的抑制活性
[0097][0098]
从表7的数据可以得知，本发明制备的化合物对水稻分蘖均具有不同程度的抑制效果。在2um的测试浓度下，化合物ii-19和ii-13对水稻分蘖芽的生长有强烈的抑制作用，平均分蘖数分别为1.4和1.6个，活性最好，抑制效果显著优于gr24(2.6个)；其次是化合物ii-04和ii-16，平均分蘖数均为2.3个。该化合物成本低廉，在农业生产上具有潜在应用价值。
[0099]
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本技术中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。

技术特征：

1.式i所示化合物：式i中，r表示苯环上的取代基，选自氢、卤素、硝基、氰基、c1～c4直链或支链烷基、c1～c4烷氧基、卤素取代的c1～c4烷基、酰基、芳杂基、杂环基、羧基、或与苯环稠合的芳杂基、杂环基中的至少一种。2.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于：式i中，r为氢、2-氟、3-氟、4-氟、2-氯、3-氯、4-氯、2-溴、3-溴、4-溴、2-甲基、3-甲基、4-甲基、2-甲氧基、3-甲氧基、4-甲氧基、3,4-二氯、2,5-二氯、h、3,4-亚甲二氧基中的至少一种。3.根据权利要求1或2所述的化合物，其特征在于：式i所示化合物为如下化合物中的任意一种：4.制备权利要求1-3中任一项所述化合物的方法，包括如下步骤：使得式ii所示化合物与式iii所示化合物在缩合试剂存在下进行酯化缩合反应，得到式ⅰ所示化合物；
式ii中r与式i中r相同。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述缩合试剂为dic、diea、dcc、dmap、edci和hobt中的至少一种；所述酯化缩合反应在-10～60℃下进行，反应时间为2-24h；所述式ii所示化合物和所述式iii所示化合物的摩尔比为1:0.8～10。6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于：所述酯化缩合反应在有机溶剂中进行，所述有机溶剂选自环己烷、己烷、四氢呋喃、二氯甲烷、1,4-二氧六环、乙酸乙酯、甲醇、乙醇、正丙醇、四氯化碳、dmf、氯仿、二乙醚、乙腈中的至少一种或两种及以上的任意组合。7.权利要求1-3中任一项所述式i所示化合物作为植物生长调节剂在下述方面的应用：1)促进寄生杂草种子萌发；2)抑制植物幼苗下胚轴的伸长；3)促进植物的根毛生长；4)抑制植物的侧根生成；5)抑制植物的分枝发育；6)促进植物叶片的衰老；7)促进从枝菌根真菌菌丝的生长。8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述植物为拟南芥、水稻、小麦；所述寄生杂草为列当、独脚金。9.一种植物生长调节剂，所述植物生长调节剂含有权利要求1-3中任一项所述式i所示化合物。

技术总结

本发明公开了具有独脚金内酯活性的肉桂酰胺内酯类化合物及其制备与应用。其结构式如式I所示。本发明提供了一种结构简单、合成便捷、生物活性高的独脚金内酯类似物，同时对该类化合物进行瓜列当种子萌发、拟南芥下胚轴伸长和根生长、水稻分蘖测试，结果显示该类化合物对列当具有较好的种子萌发活性，对拟南芥下胚轴伸长、侧根生长和水稻分蘖具有较好的抑制活性。该化合物易制备，低成本，农业应用推广价值高，值得后续的深入研究开发，是具有广阔应用前景的植物生长调节剂。用前景的植物生长调节剂。用前景的植物生长调节剂。