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体外哺乳动物细胞染体畸变试验

九、体外哺乳动物细胞染体畸变试验

In Vitro Mammalian Cells Chromosome Aberration Test

1 范围

本规范规定了体外哺乳动物细胞染体畸变试验的基本原则、要求和方法。

本规范适用于检测化妆品原料及其产品的致突变性。

2 规范性引用文件

OECD Guidelines for Testing of Chemicals ( No.473, July 1997)

3 试验目的

本试验是用于检测培养的哺乳动物细胞染体畸变，以评价受试物致突变的可能性。

4 定义

染体型畸变(Chromosome-type aberration)：染体结构损伤，表现为在两个染单体相同位点均出现断裂或断裂重组的改变。

染单体型畸变(Chromatid-type aberration)：染体结构损伤，表现为染单体断裂或染单体断裂重组的损伤。

染体数目改变(Numerical aberration)：所用细胞株的正常染体数目的变化。

结构畸变(Structural aberration)：在细胞分裂的中期相阶段，用显微镜检出的染体结构改变，表现为缺失、断片、互换等。

有丝分裂指数(Mitotic index)：中期相细胞数与所观察的细胞总数之比值；是一项反映细胞增殖程度的指标。

5 试验基本原则

在加入和不加入代谢活化系统的条件下，使培养的哺乳动物细胞暴露于受试物中。用中期分裂相阻断剂（如秋水仙素或秋水仙胺）处理，使细胞停止在中期分裂相，随后收获细胞，制片，染，分析染体畸变。

6 试验方法

6.1 试剂和受试物制备

6.1.1 阳性对照物：可根据受试物的性质和结构选择适宜的阳性对照物，阳性对照物应是已知的断裂剂，能引起可检出的、并可重复的阳性结果。当外源性活化系统不存在时，可使用甲磺酸甲酯（methyl methanesulphonate (MMS)）、甲磺酸乙酯（ethyl methanesulphonate(EMS)）、乙基亚(ethyl nitrosourea)、丝裂霉素C(mitomycin C)、4-硝基喹啉-N-氧化物（4-nitroquinoline-N-oxide）。当外源性活化系统存在时，可使用苯并（a）芘[benzo(a)pyrene]、环磷酰胺(cyclophosphamide)。

6.1.2 阴性对照物：应设阴性对照，即仅含和受试物组相同的溶剂，不含受试物，其它处理和受试物组完全相同。此外，如未能证实所选溶剂不具有致突变性，溶剂对照与本实验室空白对照背景资料有明显差异，还应设空白对照。

6.1.3 受试物

6.1.3.1 受试物的配制：固体受试物需溶解或悬浮于溶剂中，用前稀释至适合浓度；液体

受试物可以直接加入试验系统和/或用前稀释至适合浓度。受试物应在使用前新鲜配制，否则就必须证实贮存不影响其稳定性。

6.1.3.2 溶剂的选择：溶剂必须是非致突变物，不与受试物发生化学反应，不影响细胞存活和S9活性。首选溶剂是培养液（不含血清）或水。二甲基亚砜（DMSO）也是常用溶剂，使用时浓度不应大于0.5%。

6.1.3.3 受试物浓度设置

（1）最高浓度的选择：决定最高浓度的因素是细胞毒性、受试物在试验系统中的溶解度以及pH或渗克分子浓度(osmolality)的改变。

（2）细胞毒性的确定：应使用指示细胞完整性和生长情况的指标，在活化系统存在或不存在的两种条件下确定细胞毒性，例如细胞覆盖程度（degree of confluency）、存活细胞计数(viable cell counts)或有丝分裂指数(mitotic index)。应在预试验中确定细胞毒性和溶解度。

（3）剂量设置：①至少应设置3个可供分析的浓度。当有细胞毒性时，其浓度范

围应包括从最大毒性至几乎无毒性；通常浓度间隔系数不大于

2 ~。

②在收获细胞时，最高浓度应能明显降低细胞覆盖程度、细胞计

数或有丝分裂指数（均应大于50%）。

③对于那些相对无细胞毒性的化合物，最高浓度应是5μl/mL，

5mg/mL或0.01mol/L。

④对于相对不溶解的物质，当浓度低于不溶解浓度时仍无毒性，

则最高剂量应是，当处理期结束时，在最终培养液中溶解度限

值以上的一个浓度。在某些情况下（即仅当高于最低不溶解浓

度时才发生细胞毒性），应使用一个以上可看见沉淀的浓度。最

好在试验处理开始和结束时均评价溶解度，因为由于细胞、S9

等的存在，在试验系统内在暴露过程中溶解度可能变化。不溶

解性可用肉眼鉴别，但沉淀不能影响观察。

6.1.4 培养液：采用MEM(Eagle)，并加入非必需氨基酸和抗菌素（青、链霉素，按100IU/mL），胎牛血清或小牛血清按10%加入。也可选用其它合适的培养液。

6.1.5 活化系统

通常使用的是S9混合物（S9 mix）。S9是从经酶诱导剂（Aroclor 1254或钠和β-萘黄酮联合使用）处理的啮齿动物肝脏获得的。S9的制备同Ames试验。S9的使用浓度为1%~10%（终浓度）。S9 mix中所加辅助因子的量由各实验室自行决定，但需对S非接触式扭矩传感器9mix的活性进行鉴定，必须能明显活化阳性对照物。也可使用下述

S9 0.125ml

MgC12 （0.4 mol/L） 0.02 ml

KC1（1.65mol/L） 0.02 ml

葡萄糖-6-磷酸 1.791mg

辅酶Ⅱ（氧化型，NADP） 3.0615mg

用无血清MEM培养液补足至1mL.

6.2 试验步骤

6.2.1 细胞：使用中国地鼠卵巢（CHO）细胞株或中国地鼠肺（CHL）细胞株。

6.2.2 试验时，应同时设阳性对照物，阴性对照物和至少3个可供分析的受试物浓度组。

6.2.3 试验前一天，将一定数量的细胞接种于培养皿（瓶）中，放CO2培养箱内培养。

6.2.4 试验需在加入和不加入S9 mix的条件下进行。试验时，吸去培养皿（瓶）中的培养液，加入一定浓度的受试物、S9 mix（不加S9 mix时，需用培养液补足）以及一定量不含血清的培养液，放培养箱中处理2h~6h。结束后，吸去含受试物的培养液，用Hanks液洗细胞3次，加入含10%胎牛血清的培养液，放回培养箱，于24h内收获细胞。于收获前2h~4h，加入细胞分裂中期阻断剂（如用秋水仙素，作用时间为4h，终浓度为1μg/mL）。

当受试物为原料时, 如果在上述加入和不加入S9 mix的条件下均获得阴性结果，则尚需补加另外的试验，即在不加S9 mix的条件下，使受试物与试验系统的接触时间延长至24h。

当难以得出明确结论时，应更换试验条件，如改变代谢活化条件、受试物与试验系统接触时间等重复试验。

6.2.5 收获细胞时，用0.25%胰蛋白酶溶液消化细胞，待细胞脱落后，加入含10%胎牛或小牛血清的培养液终止胰蛋白酶的作用，混匀，放入离心管以1000r/min~1200r/min的速度离心5min~7min，弃去上清液，加入0.075mol/L KC1溶液低渗处理，继而以新配制的甲醇和冰醋酸液（容积比为3:1）进行固定。按常规制片，用姬姆萨染液染。

6.2.6 作染体分析时，对每一处理组选200个（阳性对照可选100个）分散良好的中期分裂相（染体数为2n±2）进行染体畸变分析。在分析时应记录每一观察细胞的染体数目，对于畸变细胞还应记录显微镜视野的坐标位置及畸变类型。

人工膜肺6.3 统计处理：对染体畸变细胞率用X2检验，以评价受试物的致突变性。

6.4 结果评价：在下列两种情况下可判定受试物在本试验系统中具有致突变性：

漩涡混匀器（1）受试物引起染体结构畸变数的增加具有统计学意义，并有与剂量相关的增加。

（2）受试物在任何一个剂量条件下，引起具有统计学意义，并有可重复性的阳性反应。

在评价时应把生物学和统计学意义结合考虑。

7 试验报告

试验报告应包括以下内容：

（1）受试物名称、有关的理化性状、所用溶剂及其配制、剂量选择（应说明受试物对细胞毒性的测定方法、溶解情况等）;

（2）细胞株名称;

（3）实验条件和方法

①代谢活化系统：制备S9时所用酶的诱导剂、选用的动物品种和来源、S9mix的配方；弓箭制作

②对照物：阳性对照物名称和选用浓度；阴性（溶剂）对照物名称及使用浓度。

③培养液：所用培养液名称、血清类别和使用浓度；

④接种时的细胞密度以及所用培养皿（瓶）的规格；

⑤中期分裂阻断剂：名称、所用浓度、作用时间；

⑥处理时间：受试物与试验系统的接触时间；

⑦简述制片方法、分析的中期分裂相数目、结果评价方法。

（4）结果

①受试物最高剂量的确定及试验结果：细胞毒性的测定（建议的表格见表1）；溶解情况（建议的表格见表2）；对pH和渗克分子（osmolality）浓度的影响（如果有影响）。

②各处理组和对照组染体畸变率（建议的表格见表3）。

③本实验室的阳性对照组和阴性对照组（常用溶剂，如DMSO）在本实验室历史上的染体畸变率范围、均值和标准差（说明样品数）。

（5）结论。

表1 受试物对细胞的毒性

包边带

受试物浓度 μg/mL	活细胞计数法			分裂指数法			外墙保温用锚栓细胞覆盖程度
受试物浓度 μg/mL	接种细胞数 /mL	活细胞数 /mL	存活率 %	计数细胞数	中期分裂相数	分裂指数	外墙保温用锚栓细胞覆盖程度