采用高效液相谱法对1 d不同时间和1年不同茬次的金银花指标成分含量进行分析测定，并采用SPSS法对其进行差异分析。结果显示1 d不同时间金银花指标成分含量有差异，且随时间而变化，呈先下降后上升的趋势；1年不同茬次指标成分含量差异显著，呈先下降后上升的趋势，绿原酸质量分数为2.059%～3.593%，木犀草苷质量分数为0.110%～0.171%。因此，早上7点前和晚7点前后采摘的金银花指标成分含量较高，春天和秋天采摘的金银花指标成分含量较高，夏天采摘的金银花指标成分含量较低，为金银花的全程质量监控和科学合理采收利用提供了理论支撑。 标签： 金银花；高效液相；绿原酸；木犀草苷
金银花为忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thunb的干燥花蕾或带初开的花，具有清热解毒，凉散风热的功效[1]。植物忍冬适应性很强，除黑龙江、内蒙古、宁夏、青海、新疆、海南和西藏无自然生长外，全国各省（区、市）均有分布。其商品药材主要来源于栽培品种，以河南封丘的“南银花”或“密银花”和山东的“东银花”或“济银花”产量最高，品质也最佳[2-3]。
绿原酸和木犀草苷为植物金银花的次生代谢产物，也是金银花的指标成分，绿原酸具有利胆、抗菌、降压、增高白血球及兴奋中枢神经系统等多种药用功能[4]，木犀草苷具有较强的杀菌消炎，解热镇痛的功效。现代研究表明，品种资源、生境、产地、物候期、采收时期、炮制方法、贮藏时间等因素都影响金银花中指标成分的含量，植物金银花的变异、采收时期和生长环境因子是影响生药品质的重要因素[5-8]。
本实验利用河南封丘的道地药材主栽品种大毛花，研究了1 d不同时间和1年不同茬次采摘的金银花指标成分含量的变化规律，为金银花全程质量监控和科学合理采收利用提供理论支撑。
1材料
1 d不同时间金银花鲜花蕾材料采自河南省封丘县贾庄金银花示范田，采集时间为2012年7月14日，1年不同茬次金银花鲜花蕾材料采自河南省封丘县贾庄金银花示范田，采集时间为2012年5月1日—2012年10月15日，药材样品由河南师范大学植物学李发启副教授鉴定为L. japonica，为主栽品种封丘大毛花。烘干，按2010年版药典规定方法测供试样品的含水量，均小于12.0%，粉碎，过4号筛，孔径（250±9） μm。
2方法
2.1绿原酸含量测定
2.1.1谱条件 谱柱填充剂十八烷基硅烷键合硅胶；检测波长327 nm；进样量10 μL；流动相乙腈-0.4%磷酸溶液（13∶87），流速1.0 mL·min-1。
2.1.2对照品溶液制备 精密称取绿原酸对照品5.2 mg，置25 mL棕量瓶中，加50%甲醇制成每1 mL含208 μg的溶液，即得。
2.1.3金银花绿原酸样品溶液制备 分别精密称定金银花样品的粉末各0.500 0 g，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，称定质量，超声处理（功率250 W，频率35 kHz）30 min，放冷，再称定质量，用50%甲醇补足失重，摇匀，过滤，精密量取滤液5 mL，置25 mL棕量瓶中，加50%甲醇至刻度，摇匀，即得[4]。
2.1.4测定法 对照品与供试品溶液各进样10 μL进行液相谱分析，按外标峰面积法计算绿原酸的含量。
发热手套
藤球制作2.1.5线性关系 精密吸取上述对照品溶液0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mL，置5 mL 量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度，摇匀。将各个浓度的对照品溶液进样10 μL 进行液相谱分析。以绿原酸对照品质量浓度为横坐标，绿原酸峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得线性回归方程为Y=27.251X+22.875，r=0.999 6，绿原酸在20.8～104 mg·L-1线性关系良好。
2.1.6精密度试验 取同一对照品溶液，按含量测定方法及谱条件进行测定，重复5 次测定绿原酸峰面积，RSD 0.20%，表明仪器精密度良好。
2.1.7稳定性试验 取对照品溶液及供试品溶液，于室温分别放置0，2，4，8，10，16，20，24 h，按上述谱条件进样10 μL，测定绿原酸峰面积，对照品及供试品的RSD 分别为0.64%，0.73%，结果表明对照品及供试品溶液在24 h 内稳定。
2.1.8重复性试验 精密称取同一批金银花样品3 份，按含量测定方法进行测定，样品的绿原酸平均质量分数为3.545%，RSD 1.3%，表明本实验方法重复性良好。
2.1.9数据处理 试验数据采用Excel 和SPSS 统计分析软件进行计算和分析，以±s来表示结果。
2.2木犀草苷含量测定
2.2.1谱条件 谱柱填充剂十八烷基硅烷键合硅胶；检测波长350 nm；进样量10 μL；流动相：乙腈为流动相A，0.5%的冰醋酸为流动相B，流速1.0 mL·min-1，进行梯度洗脱，0～15 min，流动相A 10%～20%；15～30 min，流动相A 20%；30～35 min，流动相A 20%～10%；35～40 min，流动相A 10%。
2.2.2对照品溶液制备 精密称取木犀草苷对照品5.9 mg，加70%乙醇制成每1 mL含236 μg的溶液，即得。
2.2.3金银花木犀草苷样品制备 分别精密称定金银花样品的粉末各2.000 0 g，置具塞锥形瓶中，精密加入70%乙醇50 mL，称定质量，超声处理（功率250 W，频率35 kHz）1 h，放冷，再称定质量，用70%乙醇补足减失的质量，摇匀，过滤，精密量取滤液10 mL，回收溶剂至于，残渣用70%乙醇溶解，转移至5 mL量瓶中，加70%乙醇至刻度，摇匀，即得[4]。2.2.4测定法 对照品与供试品溶液各进样10 μL 进行液相谱分析，按外标峰面积法计算木犀草苷的含量。
2.2.5线性关系 精密吸取上述对照品溶液0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mL，置5 mL 量瓶中，加70%乙醇稀释至刻度，摇匀。将各个浓度的对照品溶液进样10 μL 进行液相谱分析。以木犀草苷对照品质量浓度为横坐标，木犀草苷峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得线性回归方程为：Y=21.313 1X-39.646，r=0.999 7，木犀草苷在23.6～118 mg·L-1线性关系良好。
2.2.6精密度试验 取同一对照品溶液，按含量测定方法及谱条件进行测定，重复5 次测定木犀草苷峰面积，RSD 1.8%，表明仪器精密度良好。
2.2.7稳定性试验 取对照品溶液及供试品溶液，于室温分别放置0，2，4，8，10，16，20，24 h，按上述谱条件进样10 μL，测定木犀草苷峰面积，对照品及供试品的RSD分别为2.9%，3.1%，结果表明对照品及供试品溶液在24 h内稳定。
2.2.8重复性试验 精密称取同一批金银花样品3 份，按含量测定方法进行测定，样品的木犀草苷平均含质量分数为0.176%，RSD 3.6%，表明本实验方法重复性良好。
2.2.9数据处理 试验数据采用Excel 和SPSS 统计分析软件进行计算和分析，以±s来表示结果。
枳橙3结果
3.11 d不同时间金银花指标成分含量的变化趋势
通过对1 d不同时间封丘大毛花指标成分绿原酸和木犀草苷含量的测定，见图1。
由图1可知，绿原酸质量分数为2.558%～3.028%，木犀草苷质量分数为0.112%～0.141%，5：00绿原酸和木犀草苷最高，随着时间的推移，逐渐降低，13：30时达到最低，随后又逐渐升高；5：00，7：00，19：00采收的金银花绿原酸和木犀草苷含量均较高，说明温凉环境有利于次生代谢产物的积累；随着时间推移指标成分含量降低，说明光照增强、温度升高不利于次生代谢产物的合成和积累。结果说明1 d中早上太阳升起露水落前及傍晚太阳落山前后采收的金银花指标成分较高，质量也较好。
3.21年不同茬次金银花指标成分含量的比较
通过对1年不同茬次封丘大毛花指标成分绿原酸和木犀草苷含量的测定，见表1。
由表1可知，在1年内绿原酸质量分数为2.059%～3.593%，一茬绿原酸含量最高，与其他
差异极显著，五茬绿原酸含量最低，与四茬差异显著，与其他差异极显著；木犀草苷质量分数为0.110%～0.171%，一茬含量最高，与其他差异极显著，四茬最低，与三五茬差异显著，与其他差异极显著。因此从指标成分含量考虑，5月份第一茬采收的金银花绿原酸含量最高，6—9月份采收的绿原酸含量逐步下降，10月份第六茬绿原酸含量又有所回升。5月份第一茬花发育期间，气温逐渐回升，但日均气温不超过20 ℃，较适宜新梢的生长和花芽分化[5]，此时降水量很小，气候较干燥，而日照时数逐渐增加，有利于金银花的绿原酸积累；6到9月份第二、三、四、五茬花发育期处于夏季高温多雨季节，不利于枝叶组织充实和花芽分化，而且降水量大，也不利于绿原酸的积累[5]；10月份第六茬花发育期处于秋季，气温回落，降水减少，有利于花芽发育，也利于绿原酸的积累，因此，第六茬花的绿原酸含量有所回升。5月份第一茬采收的金银花木犀草苷含量最高，10月份第六茬采收的木犀草苷含量次之，其他月份采收的木犀草苷含量较低。这也是由于光照、温度、水分等因素共同影响的结果。由此说明一年中春花和秋花指标成分较高，质量也较好，夏花次之。
4讨论
太白参
植物次生代谢产物在植物提高自身保护和生存竞争能力、协调与环境关系上充当着重要角[10]，其产生和分布通常有种属、器官、组织和生长发育期的特异性，同时受到环境中各种因素的影响[11]。本实验采用金银花道地产区封丘主栽品种大毛花为实验材料，皆在二白至大白期采摘，统一方法烘干并测定其指标成分；探讨了1 d不同时间和1年不同茬次指标成分含量的变化趋势与环境因子的关系；结果表明相对于生长的胁迫环境可提高次生代谢[12]。
pam加药
由于光照、温度等因素的影响，1 d不同时间采收的金银花的指标成分含量随时间而变化，呈先下降后上升的趋势，5：00，7：00，19：00采收的金银花指标成分均较高，说明每天5：00—7：00和19：00前后采收金银花的质量较好，即早晨太阳升起前和傍晚太阳落山前后采收较好，这是对传统采药的最佳时期（太阳升起露水落之前采收的药材药效最好）的理论支撑。
由于光照、温度和水分等因素的影响，1年不同茬次指标成分含量差异显著，呈先下降后上升的趋势，一方面与初生代谢产物供应水平有关，另一方面受到光照、温度和水分条件的制约。相对来说，春秋季节胁迫环境利于金银花次生代谢产物的合成和积累，而夏季环境
则利于金银花初生代谢产物的合成和积累，不利于次生代谢产物的合成和积累，因此一年不同茬次采收的金银花，春天和秋天指标成分含量较高，而夏天指标成分含量则较低，即春花和秋花质量较好，这为金银花的收购并实行优质优价提供了理论依据。
药材质量取决于次生代谢产物的合成和积累，而绿原酸和木犀草苷是金银花的主要次生代谢产物。本研究为金银花的质量监控和合理利用提供了理论依据，也为深入研究中药材次生代谢产物及道地药材形成机制、创造和控制有利于次生代谢产物合成和积累的条件、培育和生产优质药材提供了理论支撑。
[参考文献]
[1] 中国药典. 一部[S]. 2010：205.t5电子镇流器
[2] 中国科学院中国植物志编辑委员会. 中国植物志. 第72卷[M]. 北京：科学出版社，1988：236.[3] 李建军，李军芳，贾国伦. 金银花研究进展概述[J].生物学教学，2012，37（6）：2.
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