(一)原理
透射电子显微镜(transmission electron microscope,TEM)是利用阴极发射的电子，通过阳极中央的微孔形成的电子束穿透样品获得样品的电子信号，经物镜、中间镜和投影镜等多级电子放大至数百至数千万倍，最后成像在荧光屏上便可即时观察，或是投射到照相底片感光片上作为永久记录。由于标本必须置于高真空中进行电镜观察，所以电镜观察的生物标本必须特殊制备，不能含水，离体的生物标本要迅速加以固定，以防产生结构改变。另外，电子的穿透力很弱，这就需要把样品制成50nm～100nm厚的超薄切片(一个细胞切成100～200片)。为了使柔软的生物组织能够制成这样薄的切片，并使切片耐受高真空和电子轰击，所以在切片前要进行包埋。超薄切片技术是透射电镜观察成功的关键。 超薄切片制作样品过程大体分为取材、固定、漂洗、脱水、渗透包埋与聚合、切片、染等。细胞超薄切片技术中如何把细胞完整无损地从培养瓶皿壁上包埋下来是最大的难题。新的定型产品无菌聚苯乙烯塑料薄膜的使用解决了这个难题，把薄膜放在培养瓶皿中，让细胞直接长在塑料薄膜上，不仅细胞生长效果好，而且可与细胞一起包埋切片，省去了许多麻烦。
(二)超薄切片基本操作步骤
试剂和器具准备：
（1）0.2 mol/L PBS
A液：磷酸氢二钠（Na2HPO4·2H2O）35.61g加双蒸水溶解至1000ml。
B液：磷酸二氢钠（NaH2PO4·2H2O）31.21g加双蒸水溶解至1000ml。
根据不同要求，按不同配比，可得不同pH的0.2 mol/LPBS。见下表。
称重装置
不同配比的PBS的pH |
pH（25℃） | 7.0 | 7.2 | 7.4 | 7.6 |
A液/ml | 30.5 | 36.0 | 40.5 | 43.5 |
B液/ml | 19.5 | 14.0 | 9.5 | 6.5 |
| | | | |
（2）2.5%戊二醛（C5H8O2）固定液：25%戊二醛10ml，0.2mol/L PBS 50ml，加双蒸水
40ml。
（3）1%四氧化锇（OsO4）固定液
1）2%储存液：取1g OsO4 安瓿泡酸48h，冲洗48h，双蒸水漂洗30mins。干后用玻璃刀刻划1或2道痕，置入棕磨口瓶，加双蒸水50ml，用力摇动使安瓿破碎。静止48h OsO4溶解后备用。4℃避光保存。
2）1%使用液：取2% OsO4储存液10ml，加0.2M PBS 10ml混合。
（4）不同浓度的乙醇溶液：用无水乙醇稀释成95%，85%，70%，50%，30%的乙醇。
（5）环氧树脂Epon812包埋剂（Luft）：
A液：Epon812 612ml，DDSA 10 ml。
电子管功放电路
B液：Epon812 10ml， MNA 8.9 ml。
使用时根据不同硬度要求按一定比例（1:1~1:9）混合，A液多，则软。AB液混匀后，逐滴加入DMP-30，其浓度控制在1%~2%。边加边搅，充分搅拌30min左右。
（6）乙酸铀染液：乙酸双氧铀UO2（C2H3O2）2·2H2O（uranium acetate）溶于50%-70%乙醇溶液中至饱和，静置1-2天，使未溶解的部分沉淀，取上部黄透明溶液用，避光保存。
（7）柠檬酸铅溶液
1）A液：Pb（NO3）2（必须为新进产品）1.33g，柠檬酸钠（Na3C6H5O7·2H2O）1.76g，双蒸水（用前加热沸腾后冷却）30ml，充分摇匀，混悬液为乳白柠檬酸铅铬合物。
2）B液：NaOH 1mol/L。
3）使用液：A液配置完毕30min后，加B液8ml，加双蒸水至50ml混匀，溶液清亮（pH=12）。如有沉淀，离心后再用。最多保存半年。
（8）铜网：细胞样品用250目，纳米材料用300-400目。
有支持膜的铜网400元/100片；无支持膜的铜网50元/100片。
1、取材
铝合金去毛刺机
(1)离心法 适用于悬浮生长细胞或单层生长细胞，欲观察细胞内部超微结构，取对数生长期的细胞低速离心，令细胞沉于锥形离心管底部，吸除上清液，立即加100ul 2.5%戊二醛固定。
(2)原位法 将无菌的聚苯乙烯薄膜(已消毒包装的成品)剪成适宜的小块置入培养瓶中，然后接种细胞悬液，待细胞附于薄膜上并生长后，取出进行固定。
2、固定
将离心管中的细胞团块（约0.5mm*0.5mm*1mm）移入1.5ml EP管中，在4℃用0.1M PBS漂洗3次，每次10分钟。再用1% 在4℃固定30分钟，接着用PBS漂洗3次。
3、脱水
用系列丙酮在室温下脱水。
30% 乙醇溶液1次，5-10分钟。
50% 植物蛋白提取乙醇溶液1次，5-10分钟。
70% 乙醇溶液1次，5-10分钟。
85钥匙胚% 乙醇溶液1次，5-10分钟。
95% 乙醇溶液1次，5-10分钟。
100% 乙醇溶液2次，每次5-10分钟。
100% 丙酮溶液2次，每次5-10分钟。
4、浸透
吸弃瓶中脱水剂，加3mL纯丙酮-EPON812包埋剂(1:1体积比)，室温下放置30分钟后，弃去稀释的包埋剂，加纯包埋剂1mL，室温放置2小时或过夜。
5、包埋
(1)细胞团块 吸取混合包埋剂滴2滴于2号胶囊模块孔的底部，把细胞团块移入胶囊底部中
心，注满混合包埋剂，放60℃烤箱烘烤2小时，使之固化成硬块。
(2)细胞薄膜 将预先干燥的EPON明胶囊注满混合包埋剂，倒盖在单层细胞上，在60℃固化24小时。
6、修块 将包埋块安装在特制的夹具上，在显微镜下用单刃刀片修整去除表面的包埋剂，并做记号以便定位。 7、切片 先将包埋块固定在超薄切片机上，切厚约1μm的半薄切片，用苏木素-伊红染法染。镜下观察细胞图像，确定进行超薄切片的部位，并作标记。准备φ3mm，150～200目的铜网，用清洗液清洗，并用无水乙醇脱水干燥。制备好支持膜，小心放在铜网上。在超薄切片机上安装三角形玻璃刀，固定包埋块，切取50～70nm厚度的超薄切片，用睫毛笔挑选切片并用钢丝环套取切片，贴在铜网有支持膜的一侧，保存在干燥器皿中待染。
8、电子染：用一干净培养皿，内放干净的牙科石蜡片。在石蜡片上加1至数滴醋酸铀染液，用镊子夹住载网边缘，把贴有切片的一面朝下，使载网浮在液滴上，盖上培养皿染5～30分钟，染后尽快用双蒸水清洗三次。用滤纸吸去载网多余的水分，置培养皿内
自然干燥。再将载网放在另一只备有蜡片的培养皿中以同样方法进行柠檬酸铅的染及清洗。片染后凉干待观察。
培养细胞的TEM样品取材方法
1．观察培养细胞，确定细胞数量≥105， 确定最佳取样时间；
2．测培养基Ph值，调整3%戊二醛固定液Ph值与之相同；
3．如果是贴壁细胞，须用较软的细胞划子小心刮下贴壁细胞；
4．在细胞悬液中，加入与原液等量3%戊二醛固定液（预冷）， 停留3-5分钟（这一步操作对于需要保存所有细胞是必要的；如果只是观察贴壁细胞，可直接弃去培养液，加入3%戊二醛，停留3-5分钟）；
5．把细胞悬液置入一洁净尖底EP管（1-2ml）；如果细胞量大，可使用较大尖底离心管；
6．低速离心（依细胞大小，选择最佳离心速率和时间），至管底端形成一絮状细胞团块，
弃去上清液；
7．注入3%戊二醛固定液，3000-5000转离心（依细胞大小，选择最佳离心速率和时间），至出现致密细胞团块，用牙签轻取细胞团块置入新EP管+3%戊二醛，即送专业实验室，进入TEM样品制备程序。
说明： 用牙签轻取细胞团块时，如果细胞呈分散状，则：
1．在上述EP管中注入10 μl琼脂（0.5%热容，尽可能少量）；
2．再次 3000-5000转离心（依细胞大小，选择最佳离心速率和时间），
至EP管底部出现致密的细胞团块；即送专业实验室，进入TEM样品制备程序。
3．每种细胞（或细菌）大小不同，其最佳离心富集速率和时间也不同。
应充分检索文献并确认该细胞的富集速率和时间再着手实验，避免反复离心损伤细胞。
（请严格按要求取材，否则容易造成TEM下可见的人工损伤。）
扫描电镜细胞样品制备
(一)原理
超薄切片实际上是样品的二维切片，不能表达细胞的三维结构，而且在观察由切片所拍摄的显微照片时，容易造成错误的印象。用扫描电子显微镜(Scanning electron microscope,SEM)能直接观察标本表面的三维空间结构，真实地反映各种细胞表面和断裂面的形貌特征。其照明源与透射电镜基本相同，由电子发射的电子束经聚光镜会聚成极细的电子探针，电子探针受扫描发生器控制，在样品表面逐点逐线地扫描，样品被电子轰击所产生的二次电子被收集、转换、放大，在电视荧光屏上同步扫描成像。二次电子的发射量与样品的表面形貌有关，从而在荧光屏上出现表面起伏的样品的立体图像。扫描电镜细胞样品的预处理包括取材、固定、脱水等。
(二)基本步骤
(1)取材 一般原则与超薄切片相似，但用于扫描电镜观察的样品块略大，通常为5×8mm左右。
(2)固定 铺片培养的细胞取出浸入PBS中，漂洗细胞表面。然后将细胞铺片放入青霉素小瓶中，加4℃预冷的3% 戊二醛，在4℃固定2小时或过夜，吸出固定剂，用PBS浸洗2次，每次10分钟，再用4℃引道结构图预冷的1% 锇酸，在4℃固定1小时，然后用PBS浸洗2次，每次10分钟。
(3)脱水 丙酮/醋酸异戊酯(1:1)10分钟，接下来醋酸异戊酯30分钟，或用系列梯度酒精(30%、50%、70%、80%、90%、95%和100%)脱水，每种浓度酒精通过2次，每次15分钟。
(4)干燥 以临界干燥法最理想，但必需要有专门的仪器，当实验室不具备此种仪器时，可采用冰冻干燥法和乙腈干燥法。乙腈干燥法的关键是乙腈置换。样品经上述处理后，浸入50%的乙腈水溶液中，然后依次更换70%、80%、90%、95%、100%的乙腈溶液，每次浸泡15～20分钟，最后再换100%乙腈。然后进行真空干燥。即将乙腈置换后的样品连同青霉素瓶一起放到真空镀膜台的空中置内，抽低真空，一般需30～50分钟。样品干燥后，待其温度升至室温时再放气，取出样品。
(5)样品导电处理：用真空喷镀法。所用仪器为真空喷镀仪，样品被安置在离蒸发源约10～
15cm处的样品台上，样品进行旋转活动，先喷碳后喷金，喷镀应均匀，完成后待镜下观察。
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