江西农业学报㊀２０２１，３３（０４）：５２ ５８
ＡｃｔａＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｅＪｉａｎｇｘｉ
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ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｊｘｎｙｘｂ．ｃｏｍ
ＤＯＩ：１０．１９３８６／ｊ．ｃｎｋｉ．ｊｘｎｙｘｂ．２０２１．０４．０９
谈峰，王莹，李玉娟
㊀
㊀收稿日期：２０２０－０８－１７
基金项目：江苏省农业科技自主创新资金［ＣＸ（１９）３１２１］㊂
作者简介：谈峰（１９６２─），男，江苏海安人，助理研究员，主要从事园林观赏植物研究㊂
（江苏沿江地区农业科学研究所，江苏南通２２６５４１）
摘㊀要：应用植物器官的内部组织，经过高盐培养基，分离出组织内部的共生性菌株的技术，获取具有耐盐㊁
共生㊁提高植物在盐协迫条件下能成活的菌株㊂获得的菌株经过培养过程中的系列观察㊁分析确认其属于细菌界；经过耐盐性试验，得出在３５％的过饱和盐浓度下仍能正常生长，不同盐浓度仅对其恢复生长的时间有影响的结论；经过０．６％植物耐盐性试验，得出其具有提高植物耐盐成活率的能力；经过基因测序㊁拼接㊁１６ＳＤＮＡ片段分析㊁ＮＣＢＩ数据库ＢＬＡＳＴ对比分析，鉴定其为Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属下的１个未见报道的种，暂名为ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓＧ． 关键词：内生细菌；耐盐性；基因测序；ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓＧ
中图分类号：Ｑ９３９．１１＋２㊀文献标志码：Ａ㊀文章编号：１００１－８５８１（２０２１）０４－００５２－０７
ＩｓｏｌａｔｉｏｎｏｆＡＳｔｒａｉｎＳｐｅｃｉｆｉｃｆｏｒＰｌａｎｔＳａｌｔＴｏｌｅｒａｎｃｅ
ＴＡＮＦｅｎｇ，ＷＡＮＧＹｉｎｇ，ＬＩＹｕ－ｊｕａｎ
（ＪｉａｎｇｓｕＲｉｖｅｒｉｎｅＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｎａｎｔｏｎｇ２２６５４１，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｂｙｔｈｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｏｆｉｓｏｌａｔｉｎｇｓｙｍｂｉｏｔｉｃｓｔｒａｉｎｓｆｒｏｍｔｈｅｉｎｔｅｒｎａｌｔｉｓｓｕｅｓｏｆｐｌａｎｔｏｒｇａｎｓｔｈｒｏｕｇｈｈｉｇｈｓａｌｔｍｅｄｉｕｍ，ｔｈｅｓｔｒａｉｎｓｗｉｔｈｓａｌｔｔｏｌｅｒａｎｃｅ，ｓｙｍｂｉｏｓｉｓａｎｄｉｍｐｒｏｖｉｎｇｔｈｅｓｕｒｖｉｖａｌｒａｔｅｏｆｐｌａｎｔｓｕｎｄｅｒｓａｌｔｓｔｒｅｓｓｗｅｒｅｏｂｔａｉｎｅｄ．Ａｆｔｅｒａｓｅｒｉｅｓｏｆｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎａｎｄａｎａｌｙｓｉｓｉｎｔｈｅｐｒｏｃｅｓｓｏｆｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ，ｔｈｅｏｂｔａｉｎｅｄｓｔｒａｉｎｓｂｅｌｏｎｇｅｄｔｏｔｈｅｂａｃｔｅｒｉａｌｋｉｎｇｄｏｍ．Ａｆｔｅｒｓａｌｔｔｏｌｅｒａｎｃｅｔｅｓｔ，ｉｔｗａｓｃｏｎｃｌｕｄｅｄｔｈａｔｔｈｅｓｔｒａｉｎｃｏｕｌｄｓｔｉｌｌｇｒｏｗｎｏｒｍａｌｌｙｕｎｄｅｒ３５％ｓｕｐｅｒｓａｔｕｒａｔｅｄｓａｌｔｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ，ａｎｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｓａｌｔｃｏｎ⁃ｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｎｌｙａｆｆｅｃｔｅｄｔｈｅｒｅｃｏｖｅｒｙｔｉｍｅｏｆｇｒｏｗｔｈ．Ａｆｔｅｒ０．６％ｐｌａｎｔｓａｌｔｔｏｌｅｒａｎｃｅｔｅｓｔ，ｉｔｉｓｃｏｎｃｌｕｄｅｄｔｈａｔｔｈｅｓｔｒａｉｎｈａｄｔｈｅａ⁃ｂｉｌｉｔｙｔｏｉｍｐｒｏｖｅｔｈｅｓｕｒｖｉｖａｌｒａｔｅｏｆｐｌａｎｔｓａｌｔｔｏｌｅｒａｎｃｅ．Ａｆｔｅｒ
ｇｅｎｅｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，ｓｐｌｉｃｉｎｇ，１６ＳＤＮＡｆｒａｇｍｅｎｔａｎａｌｙｓｉｓａｎｄＮＣＢＩｄａｔａｂａｓｅＢＬＡＳＴａｎａｌｙｓｉｓ，ｉｔｗａｓｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄａｓａｎｅｗｓｐｅｃｉｅｓｏｆＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ，ｔｅｍｐｏｒａｒｉｌｙｎａｍｅｄＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓＧ．
铍铜Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃｂａｃｔｅｒｉａ；Ｓａｌｔｔｏｌｅｒａｎｃｅ；Ｇｅｎｅｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ；ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓＧ
㊀㊀盐碱土的改良途径有很多，但是重盐碱地的改良必先从高耐盐植物的种植开始，而林木的利用是最高效的㊂但在自然界中可供利用的高耐盐林木资源极其匮乏，改良林木的耐盐性是一个重要的扩展资源的途径，育种改良固然是一个可行的途径，但其周期长㊁效率低，目前的研究认为可以通过利用改良基质先行以提高植物耐盐性，进而在土壤中实际应用少量基质而达到让低耐盐树种在中高含盐量土地上存活并逐步适应生长［１］，而在这个技术途径中的一个关键因子是高耐盐菌株及其可利用途径的获得㊂
自然界中高耐盐微生物是存在的，主要以土壤生境和植物内生生境的方式存在，而针对研究
目的而言，植物内生耐盐菌是首选的研究对象，尤其以植物内生耐盐细菌为优㊂
植物内生细菌（Ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃｂａｃｔｅｒｉａ）是指能在健康植物组织内栖居，而对植物不造成任何实质性危害的微生物［２］㊂从植物根瘤菌的开发应用到茯苓的大规模人工栽培，无不表现出植物共生菌在人类改造自然㊁应用自然中的主观能动性的积极作用㊂在提高植物对盐碱条件的适应性方面，共生菌也存在天然的优势㊂有研究表明，内生细菌能够促进植物生长㊁促进生物固氮㊁增强宿主抗病虫害㊁抗逆能力等㊂Ｍａｓｏｎ发现盐渍土植物共生菌对改进植物在盐渍土上的生长，提高植物耐盐性有着极大的作用［３］㊂Ｇｕｐｔａ等发现在盐胁迫下
对玉米接种ＡＭ真菌在不施用磷肥的条件下与不接种ＡＭ真菌但施用磷肥的植株生长量相当［４］㊂植物体内外存在大量种类丰富㊁功能多样的微生物㊂近年来，高通量测序等多种组学技术的发展揭示了植物地下微生物体的菌结构和功能，从生态和进化角度去探讨植物的耐盐策略备受关注㊂井大炜等研究发现，在一些盐生植物中也含有这些有类似功能的菌，如嗜盐菌，而这些菌是具有增强植物耐盐力的能力的［５］㊂Ｂｕ等研究发现，内生菌可以有效保护水稻叶片保护酶系统，从而提高水稻的耐盐碱性［６］㊂在研究特定基质时，魏琦等通过对一些植物的特定共生菌的研究发现，某些植物在接种了特定耐盐菌后［７］，植物的生长，尤其是在不良条件下的生长能力得到了极大的提高㊂笔者在筛选高耐盐菌的过程中，从海滩浅水和濒水植物中分离提纯高耐盐微生物，最终在浅水大米草的根系内部发现了一株高耐盐的菌株，经过系统的试验研究，结果显示其具有提高植物耐盐性的功能，现将研究结果报道如下㊂
１㊀材料与方法
１．１㊀材料
１．１．１㊀分离材料㊀携菌植株：大米草（Ｓｐａｒｔｉｎａａｎ⁃ｇｌｉｃａＨｕｂｂ．）样本在江苏如东海滩浅水处取得，挖取过程中保留完整根系，在海水中洗去泥沙，封存备用㊂
１．１．２㊀高盐ＰＤＡ培养基㊀高盐ＰＤＡ培养基：海水（含盐２％）１０００ｍＬ㊁土豆２００ｇ㊁琼脂１４ｇ㊁牛肉浸膏１２ｇ㊁精解蛋白胨１０ｇ㊂按常规ＰＤＡ培养基制作方法制作，装试管，１２５ħ下灭菌２５ｍｉｎ，摆斜面㊂扩大培养试验以培养皿为容器㊂
dc-hsdpa育苗基质：配料为木腐菌糠３０％㊁秸秆２０％㊁双孢蘑菇菌糠５０％㊁菌糠料和秸秆料拌和均匀，腐熟发酵；配以盐浓度２％的选菌发酵液，最后培养料的含盐量调至０．６％供试验用㊂
１．２㊀方法
１．２．１㊀内生菌的分离与纯化㊀取植株的根系，经过无菌水冲洗，截取尖端组织，在无菌条件下经过无菌操作，取根尖内部组织于试管中，３０ħ下无菌培养㊂将分离获得的不同菌株分别培养，提纯培养，得到纯化的菌株㊂
１．２．２㊀微生物形态㊀通过对微生物个体及菌落的形态观察，初步界定菌物分类地位㊂１．２．３㊀菌株对提高植物耐盐性的初步鉴定㊀以获得的菌株单菌落扩大培养，制成以获得菌为主导的特殊基质，以杜梨为试验植物，检验菌物对提高植物耐盐能力的作用，确定内生菌对杜梨耐盐性的影响，选定适合菌株㊂
以２８ｃｍˑ１７ｃｍ花盆为容器移栽杜梨，根部分洗净处理㊂每样本５０株，地径１ｃｍ，定高５０ｃｍ，全去叶，以含盐２％的海水喷雾基质表面保持基质湿润㊂记录植株发芽的情况㊂生长稳定后，取样测量根系萌发数量与生长长度，以根系萌发并健康生长为指标来确定杜梨是否成活㊂１．２．４㊀菌株鉴定㊀以表现优良者，扩大培养，显微镜观察菌落形态㊂以基因测序的方法鉴定菌株分类地位㊂
革兰氏染㊁基因测序鉴定㊂测定步骤：基因组抽提㊁ＰＣＲ扩增㊁测序㊁物种鉴定㊂内生菌的１６ＳＤＮＡ片段分析㊂
采用蛋白酶Ｋ裂解的方法进行基因组ＤＮＡ抽提，以８Ｆ（５ᶄ）ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ和１４９２Ｒ（３ᶄ）ＴＡＣＧＧＹＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＹＧＡＣＴＴ为引物进行ＰＣＲ扩增㊂表１ 表３为测序所用的标准物㊂ＰＣＲ产物检测：取３μＬＰＣＲ产物于１％琼脂糖凝胶电泳检测，确定结果是否可以用于测序㊂
表１㊀１６Ｓ全长扩增选用引物序列
１６Ｓ扩增引物序列（５ᶄ－３ᶄ）
８ＦＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ
１４９２ＲＴＡＣＧＧＹＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＹＧＡＣＴＴ
表２㊀ＰＣＲ体系
引物用量
ＢｉｏＬｉｎｋｅｒ２ˑＴａｑＭｉｘ２０μＬ
正向引物１μＬ
反向引物１μＬ
模板１ ３μＬ
补ｄｄＨ２Ｏ至４０μＬ
表３㊀ＰＣＲ程序
项目温度／ħ时间
３０个循环９４３ｍｉｎ
９４３０ｓ
５６３０ｓ
７２１．５ｍｉｎ
７２５ｍｉｎ
１０１０ｍｉｎ
１．３㊀耐盐能力的鉴定
按含盐度２％㊁４％㊁６％㊁８％㊁１０％㊁１５％㊁２０％㊁２５％㊁３０％㊁３５％设置ＰＤＡ培养基，培养皿培菌，接
３５
㊀４期㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀谈峰等：１株可提高植物耐盐能力菌株的分离
种菌株，３０ħ无菌培养，观察㊁记录菌株生长情况，判定菌株的耐盐能力㊂
２㊀结果与分析
利用植物根尖内部组织切片置于专业培养基上培养，获得菌株，经过反复分离提纯，获得３个不同表现的细菌菌株 Ｂ１㊁Ｂ２㊁Ｂ３，结果见图１㊂分离的结果说明，在浅海水环境下生活的植物体内含有耐盐菌，这类菌物能与植物在盐生条件下共同生长，并不会造成对植物的伤害㊂
２．１㊀具备促进植物在盐生条件下的菌株选择经过扩大培养，制成含耐盐菌的３个基质，经过裸根移栽杜梨的试验，证明有１个菌株具有提高植物耐盐性的功能，标记为Ｂ２，结果见表４㊂表４㊀３个菌株对杜梨在盐生条件下生根率的影响
菌株生根数成活率／％
Ｂ１００
Ｂ２４２８４
Ｂ３００
㊀㊀试验的结果说明，并不是所有的植物内生耐盐菌都具有促进植物在盐生条件下生根成活的能力的，Ｂ２菌具有较高的提高植物耐盐性的能力㊂Ｂ２菌的耐盐能力：通过对Ｂ２菌在不同含盐浓度的培养皿中的试验研究，结果显示，Ｂ２菌可以在饱和盐浓度以下和基质中正常生长发育，区别是菌株恢复生长的时间不同，结果见表５㊂这说明Ｂ２菌是一株极度耐盐的菌株㊂
交通评估表５㊀Ｂ２菌在不同盐浓度条件下的生长时间
盐浓度（Ａ）／％恢复生长时间（Ｂ）／ｈ完成生长时间（Ｃ）／ｈ０２０４８
２２２４８
４２２４８
６２２４８
８２２４８
１０２４４８
１５６０４８
２０７７４８
２５９０４８
３０９０４８
３５９６４８
㊀㊀在得到初步结果后，又对１０％和１５％盐浓度间进一步分级试验，结果在盐浓度达到１３％时，菌株恢复生长时间开始延长㊂由此说明，在不同盐浓度条件下，当菌株恢复生长后，生长速度不再受盐浓度的影响㊂
２．２㊀Ｂ２菌的鉴定
以接种环取菌，划线培养，结果显示：菌落乳白，圆珠状（图１）㊂在显微镜下观察，单细胞形态为无，长卵圆形，顶侧芽分裂生长，对比形态，属于细菌类（图２）㊂Ｂ２菌株革兰氏染结果为红，说明为阴性菌㊂
图１㊀Ｂ２菌菌落
图２㊀Ｂ２菌单菌个体
直缝焊２．３㊀测序结果
１６ＳＶ１ Ｖ９片段大小约为１５００ｂｐ，双端测序结果进行拼接，由于测序起始端测序质量较差，所以笔者去除了质量较差的序列㊂测序结果（图３㊁图４）显示Ｂ２样本测序峰单一，说明品种单一㊂㊀㊀拼接：ＦＬＡＳＨｖ１．２．１１默认参数；质量过滤：ｓｅｑｔｋｖ１．２默认参数；序列结果见图５㊂
２．４㊀Ｂｌａｓｔ比对结果
经ＮＣＢＩ数据库比对，结果测试菌株与数据库中相似性最高的前１０位及物种分类信息统计结果见表６㊂
㊀㊀Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｐｌｅｃｏｇｌｏｓｓｉｃｉｄａ从已知文献的报道中可以知道是鱼类的致病菌［８］，在植物中未见相关报道，Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｔａｉｗａｎｅｎｓｉｓ是一种土壤中分离的菌［９］，对砷元素有富集隔离作用，已知同属中
４５江㊀西㊀农㊀业㊀学㊀报㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀３３卷
的菌株未见有相同功能的报道，且基因序列不完全重复㊂
图３㊀Ｂ２菌正向测序结果
图４㊀Ｂ２菌反向测序结果
２．５㊀比对结果物种分类信息的注释
从表７中所列已知菌株的注册信息看，本次分离获得的菌株在Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ下无相同菌株，所列１０个最相近菌株的注册地位在属以上完全相同，从基因测序的结果说明，新菌株属于Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属，种上没有相同的菌株㊂
５５
㊀４期㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀谈峰等：１株可提高植物耐盐能力菌株的分离
２．６㊀发育树
Ｂ２菌的１６ＳｒＤＮＡ序列提交至ＮＣＢＩ进行ＢＬＡＳＴ对比后得到一系列的结果，选取与同源性比对得到的１０个同属不同种相似菌株进行系统发育树的构建，结果见图６㊂
图５㊀Ｂ２菌测序结果
表６㊀测试菌株最相近的前１０个菌株的比较结果
样本名称长度／ｂｐ标准菌株编号物种名称相似度／％Ｂ２１４０９ＮＲ＿１１４２２６．１ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｐｌｅｃｏｇｌｏｓｓｉｃｉｄａｓｔｒａｉｎＮＢＲＣ１０３１６２９９．６４５Ｂ２１４０９ＮＲ＿０２４６６２．１ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｐｌｅｃｏｇｌｏｓｓｉｃｉｄａｓｔｒａｉｎＦＰＣ９５１９９．６４５Ｂ２１４０９ＮＲ＿１１６１７２．１ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｔａｉｗａｎｅｎｓｉｓＤＳＭ２１２４５ｓｔｒａｉｎＢＣＲＣ１７７５１９９．５０３Ｂ２１４０９ＮＲ＿０２４９１０．１ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｍｏｎｔｅｉｌｉｉｓｔｒａｉｎＣＩＰ１０４８８３９９．５０３Ｂ２１４０９ＮＲ＿１１４２２４．１ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｍｏｎｔｅｉｌｉｉｓｔｒａｉｎＮＢＲＣ１０３１５８９９．４３２Ｂ２１４０９ＮＲ＿１０２８５４．１ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｅｎｔｏｍｏｐｈｉｌａＬ４８９９．２９０Ｂ２１４０９ＮＲ＿１１２０７３．１ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｍｏｎｔｅｉｌｉｉｓｔｒａｉｎＣＩＰ１０４８８３９９．００６Ｂ２１４０９ＮＲ＿０２４９２４．１ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｍｏｓｓｅｌｉｉｓｔｒａｉｎＣＦＭＬ９０－８３９９．１４８Ｂ２１４０９ＮＲ＿１１５３３６．１ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｅｎｔｏｍｏｐｈｉｌａＬ４８９９．００６Ｂ２１４０９ＮＲ＿０４０８５９．１ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｐａｒａｆｕｌｖａＮＢＲＣ１６６３６＝ＤＳＭ１７００４９９．００６
㊀㊀从测序结果的ＢＬＡＳＴ比对数据中可以看到，１０个相近菌株中，测序菌株与ＮＲ１１５３３６．１和ＮＲ０４０８５９．１两个编号的菌株关系最远，相似度９９．００６％；与ＮＲ１１４２
２６．１和ＮＲ０２４６６２．１关系最近，相似度为９９．６４５％㊂这首尾的４个菌株的属分类地位一致，均为Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属，１０个相似菌株的比对结果构成新测序菌株的系统发育树，说明该菌来自于Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属，是一个未见报道的种㊂
淀粉牙签
２．７㊀鉴定结果
基因测序的结果显示，在物种库中没有与所得菌株完全一致的已知菌株，综合测试的各项指标结果，测试菌株为一个未见注册的菌株，新获得菌株极可能是一个新的物种，暂名为
水电安装开槽机６５江㊀西㊀农㊀业㊀学㊀报㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀３３卷
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