米饭碗
Western blot 流程梳理
1.1物品：细胞，1ml/200ul/100ul 移液/头，1.5ml EP管。
1.2试剂：PBS：购买1L 装PBS粉剂配制，过滤后使用；
RIPA裂解液：1ml原RIPA裂解液+ 10 ul PMSF 配制。
1.3细胞步骤：从细胞间取6孔板———PBS洗涤：1ml移去培养液，加PBS轻柔洗涤3遍———加RIPA裂解液：150ul每孔，加液时分散点加，有助于裂解液充分接触细胞———反应5min———刮脱：用细胞刮反复刮脱细胞，微微倾斜孔板，将液体刮于一侧便于吸出，将各孔内液体分别吸到相应的1.5ml EP管中，注意应事先编号便于区分———超声震碎：按照说明震碎细胞，使细胞内蛋白充分析出———离心：超速离心机12000G 离心15min———转移：从离心机中取出样本，取出上清液与相应1.5ml EP管中，剩余沉淀舍弃，注意事先标记———各取20ul样本与另一相应EP管用于测蛋白浓度，剩余放于–80℃保存。 1.4组织提蛋白步骤：剪取组织适量(3mm*3mm*3mm左右大小)，用PBS洗去血液，滤纸吸干水分，放于1.5ml EP管中，加RIPA裂解液500ul，小剪刀伸入EP管中剪碎组织，使用电动匀浆机伸入EP管液面下充
分搅碎组织，然后离心、转移上清液的操作如前。
1.5取出用于测蛋白浓度20ul样本处理：于各EP管中分别加入180ul 三蒸水得20倍稀释液，放入4℃保存或现用。
投篮训练机
第2步：测蛋白浓度——Lorry法
2.1.配置lorry A/B液
配方：A液(250ml)：
取15ml离心管，三蒸水清洗3次，保证干净———精确称取牛血清白蛋白（ABV）20.0mg ，加入三蒸水10ml，充分混匀，得2mg/ml蛋白溶液———分装：1ml/支分装于1.5 ml EP管中；取250ul 2mg/ml蛋白溶液于1.5ml EP 管中，加三蒸水750ul，得0.5mg/ml蛋白标准品。
按下表配置0、25、50、100、200、300、400、500 ug/ml 蛋白梯度标准品各500ul，做好相应标记，4℃冰箱
事实上，实验室同学都是用购买的0.5mg/ml在96孔板上现配不同浓度标准蛋白制作标准曲线。一次性配制较多不同浓度标准蛋白优缺点如下：
优点：1.加样时加样体积较现配大，减少加样误差；2.一次性配制储存，上样时直接有现成不同浓度梯度标准品，缩短上样时间。
缺点：1.蛋白水溶液放置时间过长易降解；2.配制标准品为从试剂商购买牛血清白蛋白，较购买现成的蛋白标准品精确性差。
2.3.Lorry法测蛋白含量
使用96孔板上样，因每孔最多能装约300ul，故上样体积减半如下。
2.31取15ml干净离心管，蒸馏水涮洗3遍，00甩干水，依次加入10ml A液、100ul B液，摇匀得Lorry C液，室温反应10 min。
2.3.2 C液反应期间，各孔依次加入梯度蛋白标准溶液、样本（一般各加2组，每组8孔，同一浓度吸光度取平均值）150ul———各孔依次加入C液50 ul———各孔依次加入Folin酚15ul———暗室避光反应45min———分光光度计630 nm处测吸光度。
2.4标准曲线的绘制
实验室酶标仪设置630nm 下测定各孔内分光度———复制数据至excel表格———除去未加样品无效数据———将各梯度浓度标准品及样品重复加样所得的两个吸光度值分别取平均值。
以各梯度浓度标准品吸光度作为x变量，浓度作为y变量作标准曲线，可舍弃部分明显偏离值，在设置中显示标准公式，标准曲线α2需大于0.99才可以使用。
将各样本吸光度均值带入回归公式求得所测样本总浓度，但因所测样本实为原样本稀释20倍所得，故提取样本蛋白总浓度需乘以20。以最小浓度组体积为标准配平，分别计算要是各提取样本总蛋白浓度相等需要多少体积原液，再用PBS配平。
从–80℃冰箱取出原蛋白样本，按照计算体积配平至所需浓度，加入1/4体积的5乘loading buffer，震荡摇匀，沸水煮10min至蛋白完全变性减少降解损耗，再次放入-80℃冰箱备用。
第3步：配胶
3.1试剂：dd H2O，29%(w/v)丙烯酰胺和1%(w/v)N，N’-亚甲双丙烯酰胺储存液，pH 6.8 1M Tris-HCl，pH 8.8 1.5M Tris-HCl，10% SDS，10% AP，TEMED
配方：触指
3.2物品准备：50ml 离心管2个(分别专门用于配分离胶、浓缩胶，标签标明用途防止混淆)，离心管架，烧杯，各量程、头，配胶玻板，配胶架，配胶梳子，橡胶垫。
3.3步骤：
3.3.1.准备罐胶槽：将玻璃板擦干净烘干后，放入配胶架，两玻璃板及架子的底缘须在同一平面对齐（否则漏胶）；装上橡胶垫，将短架子装在长架子上，短架子底缘须与垫片紧密接触，否则漏胶。
3.3.2.准备：将各溶液（ddH2O，29%(w/v)丙烯酰胺和1%(w/v)N，N’-亚甲双丙烯酰胺储存液，Tris-HCl，SDS，APS，TEMED）依次摆好，调好取TEMED、APS的。
3.3.3.配分离胶：在烧杯上装半杯ddH2O；在专门装分离胶的50ml离心管中按下表所需浓度分离胶比例，依次加相应体积ddH2O，29%(w/v)丙烯酰胺和1%(w/v)N，N’-亚甲双丙烯酰胺储存液，Tris-HCl，SDS。最后加APS、TEMED，加样时要迅速，快速摇匀。用1ml将胶从玻璃板中间注入，注胶速度均匀，不要产生气泡，离心管中留少许以观察胶凝固情况。罐胶后用异丙醇压胶，注入异丙醇时要均匀轻柔。分离胶凝固约30min。
3.3.
4.配浓缩胶：分离胶离心管中交凝固时可倒掉玻板见压胶异丙醇，用滤纸吸干残留水，注意不要触及
胶面。按表格依次在浓缩胶专用50ml离心管中加入相应溶液，摇匀，迅速灌入玻板间，不要产生气泡，离心管中留少许以观察胶凝固情况。浓缩胶凝固快，灌胶后即刻轻柔插入配胶梳子，不要产生气泡。5-20min浓缩胶即可凝固。
3.3.5.配胶凝固后轻柔取下玻板，胶现用加样，也可保鲜膜包裹后放入4℃冰箱存放充分凝固。4℃过夜凝固的
胶条带更细更均匀。清洗干净配胶架后放回原处。
4.3 步骤简述
快开阀芯
4.3.1取出包有已凝固凝胶的玻板，将玻板放入电泳架，短玻板朝里，长玻板朝外。电泳架设计夹两块胶，单块胶要加用塑料玻板。夹好的电泳架中间盛电泳液不会露水。老化电阻
4.3.2上样：把电泳架放入电泳槽，注意电极及电极方向。先从电泳架两玻板间倒入新鲜电泳液，至电泳液漫出槽内到所需量。轻柔拔出梳子，注意力道适中，不能太快，防止气泡产生。使用小头上样(有专门的上样长头)，按样本浓度计算上样体积，上样蛋白总量应至少60ug，上样体积一般20-40ul。头先伸入至快接近胶面时开始降将上样液缓缓打出，使样品液从胶面往上涨，头随液面上涨而上提。可以不把最后一滴样品打出，但是每个样品都须同样处理。
4.3.3电泳：连接电源，80V至marker分离后，130V电泳至蓝蛋白样本将近玻板下缘处停止电泳。电泳时间一般40-60min。
第5步：转膜
5.1物品准备：1乘电转液(取10乘电转液100ml + 200ml 甲醇+H2O至1L 4℃预冷备用)，甲醇，PVDF膜、转膜夹、海绵网、转膜滤纸、小盘子、冰袋等。将小盘子装适量电转液，一边放转膜夹、海绵垫、滤纸，电转液打湿备用，转膜夹黑面朝下，白面朝上。
5.2揭胶：电泳结束后，将电泳槽移至水池中，电泳液可使用1-2次，取出电泳架，取出两边玻璃板，
纯水冲干净，切胶塑料板从边角小心揭开短板，切去掉集成胶。对照marker小心将目标蛋白所在范围区域胶切下放入倒有电转液的盘子中。
5.3剪膜、激活：测量切下凝胶长宽值，剪下相应大小PVDF膜，标记右上角。在小盒子里倒入适量甲醇，用专用塑料小镊子取膜到甲醇中侵泡数秒激活。
5.4转膜：依次在转膜夹黑面放置海绵、滤纸、胶、膜、滤纸、海绵，凝胶与膜应对齐，不要有气泡，关好夹子，放入电泳槽。将电泳液倒入槽内，在电泳槽中放冰袋。电泳液有被储存液现配，含20%甲醇。
5.5转膜电泳：4℃冷藏室电泳1-2h。砖模分为恒压或恒流两种模式。实验室恒压为100V条件下砖模1h，但电源可能电压不稳，出现电压波动。恒流同实验室师用250mv，按每kd分子量1 min转膜。
第6步：封闭
6.1物品准备：脱脂奶粉，1乘TBST，12cm 培养皿，H2O，摇床。
5%脱脂牛奶：称取2.5g 脱脂奶粉溶于三蒸水中备用。
1乘TBST：取25ml 20 乘TBS加三蒸水稀释至500ml，加1ml 吐温-20摇匀备用。
油墨丝印
6.2脱脂牛奶：封闭转膜完毕，取出PVDF膜，放入含5% 脱脂牛奶溶液的12cm培养皿中摇床封闭1h。
6.3洗膜：封闭后，用1乘TBST漂洗3次，每次10min后孵育一抗。
第7步：一抗孵育
7.1 TBST洗膜后，夹取膜用干净滤纸吸干水分。
7.2 采用孵育蜡板方式孵育一抗：自来水冲洗蜡板，滤纸吸干水分，在蜡板上200ul吸取抗体逐点点加成排。镊子夹取转有相应蛋白的PVDF膜从一侧铺在相应一抗液体中，分别与相应的抗体及内参照抗体孵育，适当加滴一抗，保证膜浸泡在一抗液体中。保鲜膜密封蜡板盒4℃孵育过夜。
7.3 洗膜将孵育好一抗的膜在TBST洗涤3次，每次5分钟。
第8步：孵二抗采用一抗加样的方法加样二抗。加二抗注意与一抗种属对应，二抗在室温下孵育1小时。
第9步：显影
物品准备：ECL显影液(分A/B液)，200ul 移液器及头，滤纸，显影成像仪。
9.1 洗膜将孵育好二抗的膜在TBST洗涤3次，每次5分钟。
9.2 配ECL显影工作液避光按1：1吸取ECL A/B液混合得显影液工作液。注意务必更换头，显影液交叉污染会使显影液迅速失效。一般一块中等大小膜需约300ul 工作液，显完一块膜后胶板上剩余显影液可以继续用于下一张膜显影。显影液工作液配好后放于4℃避光存放1天内仍有效。
9.3显影避光使用显影成像仪显影。事先打开成像仪，打开显影软件预冷，预冷约需3-5min。预冷结束，打开成像仪取出放置PVDF膜的黑胶板，按膜的大小在正中均匀点加显影工作液，从TBST中取出膜，滤纸吸干，放置到胶板显影液中，不要产生气泡，膜表面适当加显影液覆盖，显影液要涂抹均匀。
9.4 运行软件，显影成像。
第11步：分析结果
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