彗星实验所用试剂的配制

1. 磷酸缓冲液溶液（PBS）：

配1000mL需:

用NaOH调节pH为7.4后，定容至1000 mL。

2. pH=7.5, 0.4 M Tris ：

配100 mL需Tris 4.8456 g，ddH2O 80 mL，调节pH=7.5后定容至100 mL。

5. 细胞裂解液（4℃保存）：

2.5 M NaCl；100 mM Na2EDTA；10 mM Tris，调pH=10；1%肌氨酸钠；临用前加1%Triton X-100，10%DMSO，配500 mL，需：

不好溶，需要少量缓慢溶解，临用时加Triton X-100 5 mL；DMSO 50 mL

6. 0.8%正常熔点琼脂糖：

配50 mL，需NMA 0.4 g，用PBS配制。

8. 配制EB溶液

称取95%EB0.0106 g，于10 mL容量瓶中定容，即配成1007 mg/L母液，稀释10倍成100.7 mg/L的EB液。吸取1.3 mL的100.7 mg/L的EB液于10 mL容量瓶定容，即配得13.09 mg/L的EB使用液。

9. 电泳缓冲液

1 mM Na2EDTA和300 mM NaOH，调pH>13，临用前将两种溶液等体积混合（预冷使用）。

1 mM Na2EDTA：称取0.0752 g Na2EDTA使用双蒸水溶解并定容至200 mL。（最好配500ml）

300 mM NaOH：称取2.5 g NaOH，用ddH2O溶解并定容至200 mL。（最好配500ml）

四、彗星实验步骤：

7、在60℃下，铺上第一层0.8% NMA 150ul，迅速盖上盖玻片，置室温下20min，使琼脂固化。

8、轻轻移开第一层盖玻片，在防眩通路灯37℃下，将约10，000-500，000个（30，000-200，000理想）的悬于10ul PBS中的受检细胞与100ul 1.0% LMA 充分吹打混匀，迅速将细胞悬液滴到第一层胶上，尽量铺薄。盖上盖玻片让其均匀铺开，置4℃15min，使琼脂固化。

9、在37℃下，移开第二层盖玻片，将50ul 0.5% LMA作为第三层，滴加在第二层含有细胞的琼脂上。置4℃15min，使琼脂固化。以上铺胶过程一定要防止气泡产生。

10、移开盖玻片，将载玻片浸入新配制的4℃裂解液中，在4℃冰浴中放置至1小时，但时间不能过长，长时间的裂解可能导致裂解液沉淀。

11、将载玻片取出，用去离子水洗去载玻片上多余的裂解液，晾干。

12、将载玻片置于水平凝胶电泳槽中的阳极端，电泳槽中盛新配制的高pH吸油茶电泳缓冲液，在缓冲液中放置20min，以便使DNA在电泳前解螺旋。

13、调整电泳槽中缓冲液面高度，使电泳仪的电压为25V（恒压），电流为铁氧体电感300mA。电泳15min。

14、电泳后，将载玻片浸入pH 7.5 的Tris-HCl缓冲溶液中进行中和15min（碱性条件影响染效果）

15、呈中性后，用无水乙醇脱水，放于冰箱中，保持载玻片处于湿润状态（可在装有载玻片的盒子中放入湿润的吸水纸）。于一周内荧光分析

16、将载玻片用30ul（13mg/L）EB水溶液染15min车联网天线，置潮湿的盒子中，用荧光显微镜在绿光下分析细胞的DNA损伤情况

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本文发布于:2024-09-21 17:36:41，感谢您对本站的认可！

标签：载玻片缓冲液裂解

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