需要溶液配方：
太阳能恒温器SDS-PAGE电泳缓冲液(10×)： 144g Glysine（甘氨酸）；
10gSDS(十二烷基磺酸钠)；
30.2g Tris Base，
用蒸馏水定容至1L
电转缓冲液（10×）：
30.2g TrisBase；
150g Glysine，
用HCl调节pH到8.5，定容到1L。
使用时，取80ml稀释到800ml，再加入200ml甲醇至1L，即可，使甲醇
浓度达到20%（硝酸纤维素膜）。如果是PVDF膜，需要先用甲醇浸泡30分钟。
Tris Buffer Solution(TBS) （10×）：
关联成像24.4g Trisbase
80g NaCl
adjust pH to 7.6 using HCl，定容到1L。
在使用时，再稀释到一乘，按1：1000加入Tween-20。即为TTBS or TBST。SDS-PAGE制胶：
30%丙烯酰氨储存液：29g Acrylamide；1g N N Methylene bis acylamide，
定容到100ML。过滤后即可使用。
10％APS(Ammonium perroxodisulfate，过硫酸氨)：0.1g 溶于1.0ml ddH2O。
2×Separation buffer (PH: 8.8)：0.75M TRIS.HCl 90.825g；0.2% SDS 10ml；
20% SDS。调节pH到8.8，定容到1L。
2×Stacking buffer(PH: 6.8)：0.2M Tris 15.14g；0.2% SDS 1g or 5ml 20%
SDS。调pH to 6.8，定容到1L。
TEMED，可以买现成的。
2×SDS凝胶加样缓冲液：
100mmol/L Tris-Cl(pH6.8);4%(m/V) SDS(电泳级)；0.2%(m/V)溴酚蓝；
20%mmol/L 二硫苏糖醇（DTT）或β巯基乙醇。
※不含硫代试剂的1×和2×SDS凝胶加样缓冲液可以在室温保存。二硫苏 糖醇（DTT）或β巯基乙醇分别配成1mol/L或14mol/L的储存液，临用前
加入。
※：奶粉为脱脂奶粉
western blot 的具体步骤
1）组织洗涤后加入3 倍体积PBS，0℃研磨。
2）180W, 6mins，0℃超声波破碎
3）5000rpm，5mins 离心，取上清。
4）加入REB(9.5ml加入0.5ml)，溴酚蓝（9.5ml加入0.5ml）。或者可以直接将细胞离心下来，用1×的SDS上样缓冲液溶解。 6）煮沸，10min
7）分装，于-20℃保存，用时取出，直接溶解上样。
二．电泳（SDS-PAGE）
建议欲检测抗原10－30kd, 用15％胶；30－100kd, 用10％胶；100－200kd，用7.5 ％胶。
1）配胶（one piece）A.分离胶。单位：ml。Total: 8ml，配胶有参考，复印一张就可以了
7.5％10％15%
2×Sep. buffer 4 4 4
30％Gel.sol 2.0 2.7 4
ddH2O 1.9 1.2 0
TEMED 8ul 8ul 8ul
10%APS 80ul 80ul 80ul
B. 浓缩胶。单位：ml。Total: 3.5ml
3％
2×Stacking. buffer 1.7
30％Gel.sol 0.35
ddH2O 1.4
TEMED 5ul
10%APS 50ul
止动环2)点样。上样蛋白量不应超过30ug/mm2. (载荷面即：如果你的胶槽是5mm×1mm, 则
载荷面为：1mm×5mm=5mm2)，
3）电泳。开始用80V电压，但是当溴酚蓝至分离胶时，用100-120V电压。
4）转移（一块胶）。
A.半干法。
a. 取六张滤纸（Bio-Rad，1mm），三张做上层滤纸，三张做下层。其中，
上层滤纸一定要比较干净，无污染。用前都用Transfer buffer 浸泡至少
五分钟。
b. 准备硝酸纤维素薄膜，用时先用甲醇浸泡1-3min.倒掉后，再用Transfer buffer 浸泡。
c. 做三明治。阳极上铺三张下层滤纸，再浸泡过的膜，再铺胶，然后铺三
实验方法互助区——蛋白区
张上层滤纸，最后铺上三张上层滤纸，盖上阴极。注意每层之间不能有
碳化稻壳
气泡。膜上用铅笔画出胶的边缘。标上下。
高吸程水泵
d. 转移，0.8mA/cm2-3mA/cm2. 经验是：100kd-200kd，用2mA/cm2，2hrs;
30-100kd用1.0-2.0mA/cm2，40mins-1.5h；10kd-30kd％用0.5-0.8mA/cm2，
15mins-40mins.
B.湿法。我们实验室用这个方法，比较好。
a. 取四张滤纸，两张做上层滤纸，两张做下层。其中，上层滤纸一定要比较
干净，无污染。
狭基线纹香茶菜b. 准备硝酸纤维素薄膜，用时先用甲醇浸泡1-3mins.倒掉后, 再用Transfer buffer 浸泡。
c. 做三明治。
e. 转移。400毫安，2小时。
三封闭：5％牛奶4℃封闭过夜，或RT 1hr.（我们一般用后者） 四第一步反应：5％牛奶或2％BSA稀释抗体（称一抗），稀释比例按抗体说明，室温孵育1小时（我们实验室是两小时，这一步4℃过夜效果会更好）
五洗涤：TBST 洗5 mins 5 次。
六第二步反应：将膜跟5％牛奶或2％BSA稀释的2 抗一起孵育，室温1hr。（不宜太长）
七洗涤：TBST 洗5 mins 5 次。
八显：ECL。
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
关于我们
投诉建议