黄业伟;徐欢欢;王素敏;李润博;王宣军;盛军
【摘 要】分析比较不同茶叶的含量及所含结合的比例,为茶叶中的准确分析、茶叶加工过程中茶多酚的氧化程度监测以及不同茶叶中的功能差异研究提供理论参考.以具有代表性的中国六大茶类样品为试样,利用低pH沉淀法结合高效液相谱法(HPLC)检测不同茶叶的含量及其结合情况.结果表明,多酚类物质氧化程度越大的茶叶所含结合的比例越大.其中,深度发酵的普洱茶(熟茶)和六堡茶中结合的比例最大(20％左右);而不发酵的绿茶中结合的比例最低(＜2％).结合的比例指标在准确判定茶叶加工过程中多酚类物质的氧化程度以及不同来源的功效差异研究中具有重要的应用潜力. 【期刊名称】《云南农业大学学报》
【年(卷),期】2015(030)002
【总页数】6页(P228-233)
【关键词】茶叶;结合;;六大茶类
【作 者】黄业伟;徐欢欢;王素敏;李润博;王宣军;盛军
【作者单位】吉林大学生命科学学院,吉林长春130012;云南农业大学,普洱茶学教育部重点实验室,云南昆明650201;云南省茶深加工工程技术研究中心,云南昆明650201;云南农业大学,普洱茶学教育部重点实验室,云南昆明650201;云南省茶深加工工程技术研究中心,云南昆明650201;云南农业大学,普洱茶学教育部重点实验室,云南昆明650201;云南省茶深加工工程技术研究中心,云南昆明650201;云南农业大学,普洱茶学教育部重点实验室,云南昆明650201;云南省茶深加工工程技术研究中心,云南昆明650201;云南农业大学,普洱茶学教育部重点实验室,云南昆明650201;云南省茶深加工工程技术研究中心,云南昆明650201;云南农业大学,普洱茶学教育部重点实验室,云南昆明650201;云南省茶深加工工程技术研究中心,云南昆明650201
【正文语种】中 文
【中图分类】S571.1
(caffeine, 1, 3, 7-三甲基黄嘌呤)是一种天然生物碱[1]，作为一种世界上应用最为广泛的精神类药物，存在于日常生活中的茶叶、咖啡、可可饮料、巧克力以及一些软饮料中[2-4]。世界上约87%的人都在消费含的产品[5]，18周岁以上的成年人每天消费约166～336 mg[6]。茶叶中的含量占干物质的2%～5%[7]，是茶叶重要的品质和功能成分。
研究表明，多聚酚羟基在低pH条件下可形成沉淀，故可利用低pH沉淀法检测茶叶中与含有多聚酚羟基的物质相结合的[8]。已有研究表明，随着普洱茶发酵程度的增加，其游离含量逐渐降低，而结合的含量越来越多[9]。哺乳动物的胃酸pH值为2左右，强酸的胃液对食物的消化、吸收具有重要意义。如果与含有多聚酚羟基的物质相结合，则这种复合物就有可能在胃酸条件下聚集沉淀，进而影响这一部分的吸收。中国是世界茶叶的故乡，是唯一具有六大茶类的国家[10]。然而，有关不同茶类中与其他物质的结合情况研究鲜见报道。试验以具有代表性的中国六大茶类水提物样品为试样，利用低pH沉淀法结合高效液相谱法(HPLC)检测不同茶叶中与多聚酚羟基的结合情况，分析比较不同茶叶中结合的比例并探索其内在规律和原因，为茶叶中的准确分析、茶叶加工过程中的质量控制以及不同茶叶中的功能差异
研究提供理论参考。
1.1 材料、试剂与仪器
1.1.1 材料
试验所用试样均为市售茶叶，共有包含六大茶类的25个茶样，样品信息详见表1。
1.1.2 试剂
(阿拉丁，USP/BP级)、乙腈(美国，TEDIA，谱纯)、三氟乙酸(德国，MERCK，谱纯)、HCl(分析纯)、NaOH(分析纯)。
1.1.3 仪器
高效液相谱仪(安捷伦1260)、低速离心机(中佳SC-3616)、超声波清洗机(上海科导超声仪器有限公司SK-18TC)、酸度计(DENVER UB-7)、DK-8AD电热恒温水槽(上海一恒科学仪器有限公司)、LGJ-1冷冻干燥机(北京亚泰科隆仪器有限公司)等。
1.2 方法
1.2.1 HPLC检测谱条件
安捷伦紫外检测器(G1314F 1260VWD)；Agilent ZORBAX SB-C18谱柱(5 μm，4.6 mm×250 mm)；流动相：A相为0.03%三氟乙酸，B相为乙腈，梯度从10%B到60%B，流速1 mL/min；柱温40 ℃；36 min内完成，检测波长280 nm，每次完成后，系统平衡15 min后再次进样[8]。
1.2.2 茶叶水提物样品的制备
称取20 g茶叶于500 mL锥形瓶中→按照料液比(g/mL)1∶10加入沸水→沸水浴中提取30 min，每5 min摇动混匀1次→再按照同样方法以料液比(g/mL)1∶5提取2次→合并滤液→冷冻干燥至粉待用。
1.2.3 低pH沉淀法检测茶叶中的结合
样品制备过程如下：配制20 mg/mL的茶粉水溶液15 mL→离心(3 000 r/min,10 min)→取上清12 mL→HCl调pH至1.5→旋涡震荡混匀2 min→离心(3 000 r/min,30 min)→分离沉淀和上清→沉淀用pH 10的NaOH溶液溶解→上清和沉淀溶液均定容至13 mL。用HPLC法分别测
固定扣定上清和沉淀中的含量，每个样品检测3次[8]。
1.2.4 数据分析
所有数据均用SPSS 17.0 (Chicago, IL, USA) 软件分析，结果以表示。
2.1 各种茶叶水提物样品中的含量
彩油泥将冷冻干燥制得的茶粉配成水溶液，经HPLC法检测，各种茶叶水提物茶粉中的含量见表2。
由表2可知，不同茶叶水提物茶粉中的含量差异较大，含量最高的为产自云南普洱的月光白普洱茶-1，含量最低者为产自福建安溪的铁观音。其他茶叶水提物茶粉样品中的含量在6.39%～11.80%之间。这些样品中的含量均在5%以上，则20 mg/mL的茶粉水溶液中的浓度在1 mg/mL以上，可用于低pH沉淀法检测样品中的结合含量和比例。
2.2 各种茶叶水提物茶粉中结合的比例
利用低pH沉淀法测定了不同茶叶水提物茶粉中结合的含量，并计算得到各个茶叶样品中结合占总的比例，结果如表3所示。
由表3可知，不同茶叶中所含结合的比例迥异(0.60%～22.30%)。结果显示，与其他茶叶相比，普洱茶(熟茶)和六堡茶中结合的含量较高，占总的20%左右。红茶样品中结合的比例为7.58%～12.50%，而属黑茶类的安化黑茶和湖北老青砖样品之间的差异较大，安化黑茶中结合的比例(2.15%)亦远低于湖北老青砖(7.43%)。黄茶和白茶样品中结合的比例在2%～6%之间。对于青茶样品而言，大红袍样品的结合比例亦较高(4.52%)。而铁观音和冻顶乌龙茶样品中结合的比例与绿茶样品接近(<2%)。普洱茶(生茶)样品中结合的比例较小(0.94%)，不同批次的月光白茶样品中结合的比例差异较大(2.32%～5.09%)。由此可见，普洱茶(熟茶)和广西六堡茶样品中的结合比例远远高于其他茶叶，红茶和湖北老青砖中样品结合的比例属中等水平，黄茶、白茶和青茶样品中也含有一定比例的结合咖啡，而绿茶样品中结合的比例普遍较低。
实验室自动清洗机的功能及其副作用已经得到了广泛的研究[11-14]，尽管FDA认可的安全性，
但过量摄入还是会对身体造成严重损害，甚至在某些情况下会导致死亡[15-16]。茶叶是的最主要来源之一，茶叶中的准确分析显得尤为重要。试验结果表明，不同茶类、不同发酵程度、不同产地对茶叶中含量的影响并无明显规律。这与自身较强的稳定性是分不开的，基本免受茶叶加工过程中的高温、湿热作用甚至微生物作用的影响而保持自身的稳定。不同的加工工艺导致茶叶中的内含成分发生不同变化，也因此具有不同的存在状态。
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研究表明，茶叶冷后浑中的主要成分是糖类(14.47%～27.62%)、(2.35%～10.43%)和儿茶素(29.86%～78.66%)[17-19]。但关于各类茶叶中究竟有多少与其他成分形成了复合物及其与茶叶加工工序之间的关系的研究甚少。不同茶叶中结合的含量结果表明，普洱茶(熟茶)和六堡茶中结合的比例最大。普洱茶(熟茶)的加工过程经历长时间的发酵，在微生物作用和湿热作用等协同下，发生茶多酚的氧化、缩合，蛋白质和氨基酸的分解、降解，碳水化合物的分解，以及各产物之间的聚合、缩合等一系列反应[20]，发酵程度较深，茶叶中的儿茶素等多酚类物质在微生物及湿热作用下几乎完全转化。与普洱茶(熟茶)类似，广西六堡茶亦是经过渥堆发酵之工序，茶多酚及其儿茶素组分含量较低或不能检出[21-22]。与之相比，发酵程度较轻的湖北老青砖[23]和安化黑茶[24]中结合咖啡发票导出
因的比例显著减小。红茶虽被归为全发酵茶，但其“发酵”时间仅为3 h左右[25]。在如此短的时间内微生物的作用极其微弱，所谓的红茶“发酵”过程实质上主要是以茶多酚类物质在酶促作用下的有氧氧化，而发酵是指微生物参与作用的转化过程。故严格意义上红茶的加工过程中几乎不存在真正意义的发酵，其茶多酚类物质的转化程度也远远低于普洱茶(熟茶)和六堡茶。与多酚类物质的转化程度相对应，红茶中结合的比例也显著低于普洱茶(熟茶)和六堡茶。有趣的是，仅因加工工艺的相对差异，同属于青茶类的铁观音、大红袍和冻顶乌龙茶却呈现出了结合比例的显著差异[26]。试验结果显示，大红袍中结合的比例显著大于冻顶乌龙茶，铁观音中结合的比例最小，这也恰好迎合多酚类物质的转化程度。此外，与不发酵的绿茶相比，轻“发酵”的黄茶[27]和白茶[28]中结合的比例亦有明显增大。
综合以上试验结果可以推断，多酚类物质氧化程度越大的茶叶中结合的比例越大。因此，根据茶叶中结合的比例可辅助判定茶叶中多酚类物质的转化程度(一定程度上指示茶叶的“发酵”程度)。据此，可将该规律应用于不同茶类的判别、同一茶类的不同工艺比较、发酵类茶叶加工过程中茶多酚的氧化程度监测、普洱茶(生茶)的储存时间等。同时，由于与茶叶中的其他成分结合形成复合物，且这种复合物会在酸性条件下形成
沉淀，则其在人胃肠中的吸收很可能会受到影响，故为进一步研究不同来源的的功效差异提供了理论参考。
**通信作者Corresponding authors：盛军(1962-)，男，辽宁本溪人，博士，教授，主要从事生物资源开发利用及其保健功能机理研究。E-mail：***************；王宣军(1974-)，男，河南汝州人，博士，副教授，主要从事生物资源开发利用及其保健功能机理研究。E-mail：*********************
【相关文献】
[1]ADDICOTT M A, YANG L L, PEIFFER A M, et al. The effect of daily caffeine use on cerebral blood flow: How much caffeine can we tolerate? [J]. Human Brain Mapping, 2009，30 (10): 3102-3114.
[2] YOUNGBERG M R, KARPOV I O, BEGLEY A, et al. Clinical and physiological correlates of caffeine and caffeine metabolites in primary insomnia[J]. Journal of Clinical Sleep Medicine, 2011，7(2): 196-203.
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