一、实验目的
掌握亚硝酸盐中毒的诊断要点。了解亚硝酸盐中毒的解毒原理和措施。
教师讲解后、学生分组操作。
三、实验属性和学时
验证，3学时。
四、实验材料和器械
兔若干只、一次性注射器、胃管、听诊器、体温计、亚硝酸盐钠、美兰、酒精棉球等。
五、实验内容
1、原理亚硝酸盐（钾）离子，在血液中使血红细胞内正常的低铁血红蛋白（氧化）氧化为异常的高铁血
红蛋白（正铁），从而失去携氧作用。
2、方法
zzcc面膜机（1）取血5mL于试管中，在空气中用力振荡15min。在有高铁血红蛋白的情况下，血液仍保持棕，健畜则由于血红蛋白与氧结合而变为鲜红。
（2）取血5mL于试管中，滴加1%（钠）溶液数滴，在有高铁血红蛋白的情况下，血液立即变为鲜红。 （3）血液分光镜检验：取血用水稀释10-20倍后置于分光镜上检验，可在红区640-650nm波长发现高铁血红蛋白的吸光谱带。当加入5%（钠）溶液数低后，由于氰血蛋白形成，此吸光带立即消失。但经急救过的家畜，高铁蛋白大部分已被还原，故用此法检验宜早进行。
（二）措施
可用特效解毒药甲蓝或甲苯胺兰溶液静脉注射，若与Vc和高渗葡萄糖（亦有较弱的还原作用）溶液合用，则疗效更佳。
1、亚甲蓝又名美蓝，为一种氧化还原剂，是本病的特效药物。
原理小剂量美蓝进入机体，在还原型辅酶Ⅰ脱氢酶的作用下，还原成“白美蓝”，可使高铁血红蛋白还原为正常的低铁血红蛋白。在此同时，本身被氧化成美蓝并重又参与反应，但大剂量美蓝进入机体，却养具有氧化作用，反使正常的低铁血红蛋白氧化成高铁血红蛋白。因此，只宜用小剂量。反映如下：剂量标准剂量为每公斤体重1-2mg，浓度为1%的酒精生理盐水或水溶液。
给药途径静脉注射或分点肌肉注射。
2、甲苯胺蓝
原理同美蓝，但其还原高铁血红蛋白的速度比美蓝7%。
剂量每公斤体重5mg，浓度为5%。
给药途径静脉注射或腹腔注射。
3、维生素C
原理使高铁血红蛋白还原为正常的低铁血红蛋白，而脱氢的Vc又被体内谷胱甘肽还原为Vc，又重新参
与高铁血红蛋白的还原过程。但其作用不及美蓝和甲苯胺蓝迅速、彻底。故常与美蓝或甲苯胺蓝配合应用。
剂量牛、马0.5—2.0g，猪、羊0.1—0.5g。
（三）亚硝酸盐中毒的复制与解放
迷宫式油封复制方法取试验动物（兔）2只，分别称量，并观察记录其呼吸、体温及可视黏膜的颜，然后，按每公斤体重58—77mg（猪）或100mg（兔）的4%亚硝酸钠溶液静脉注射。
解救待亚硝酸盐中毒症状出现后，一只用亚甲蓝或甲苯胺蓝溶液静脉注射，观察并记录解毒效果。
另一只使其自然发展，死亡后进行剖检，以观察记录病理变化。
六、作业
1、如何用快速简洁的实验室方法诊断动物亚硝酸盐中毒？
2、亚甲蓝的解毒原理是什么？怎么使用？
3、根据各组实验结果分析家兔亚硝酸盐中毒死亡或存活的原因。
实验四亚硝酸盐的定性与定量检验
一、实验目的
熟悉亚硝酸盐中毒的定性检验方法；掌握亚硝酸盐中毒的定量检验方法。
二、实验方法
教师讲解后、学生分组操作。
三、实验属性和学时
验证，3学时。
四、实验材料和器械
可见光分光光度计、半自动生化分析仪、比管、容量瓶、移液管、移液、烧杯、饲料等。
五、实验内容
（一）亚硝酸盐的定性检验
对氨基苯磺酸重氮法（格林氏法）
1、原理亚硝酸盐在酸性溶液中与与对氨基苯磺酸作用生成重氮化合物，然后与α一萘胺偶合生成紫红
偶氮染料。
2、试剂
（1）对氨基苯磺酸溶液。取0.5g对氨基苯磺酸溶于150mL12％醋酸溶液中。贮存于棕瓶中。如溶液有颜，临用时加入少许活性炭加热至80℃并过滤，即可脱。
（2）α—萘胺溶液。取α一萘胺0.2g，加水20mL，微热溶解，过滤。滤液加蒸馏水至100 mL，贮存棕瓶中。对有者可按上法脱。
3、操作方法
取2mL滤液于小试管中，加对氨基苯磺酸溶液2～3滴。2～3分钟后，再加入α—萘胺溶液2-3滴。
数分钟后，有亚硝酸盐存在时则出现紫红，颜的深浅表示亚硝酸盐含量的多少。如将试管在70℃水浴中加热数分钟，颜更明显。粗略比例如下表。
溶液的颜NO2 –的含量（毫克/升）
刚刚呈现玫瑰红小于0.01
淡玫瑰0.01-0.1
玫瑰0.1-0.2
鲜艳玫瑰0.2-0.5
深红或橙黄大于0.5
格林氏粉法
1、原理同对氨基苯磺酸重氮法（格林氏法）
2、试剂
对氨基苯磺酸 1.0g
α—萘胺0.1g
酒石酸8.9g
研磨均匀，储于棕广口瓶备用。
3、操作方法取滤液1-2 mL于小试管中，然后加入少许试粉，摇匀，如滤液变紫红，表明检材中有
亚硝酸盐存在。
联苯胺冰醋酸法
1、原理亚硝酸盐在酸性溶液中，将联苯胺重氮化生成黄或红棕颜料。
2、试剂0.1％联苯胺冰醋酸溶液：取0.1g联苯胺溶于10mL冰醋酸中，加蒸馏水稀释至100mL，过滤，
滤液置于棕瓶中备用。
3、操作方法取对氨基苯磺酸重氮法样品制备液2滴于滤纸或点滴板上，加联苯胺一冰醋酸液2滴，如
出现棕红则示有亚硝酸盐存在。
二苯胺浓硫酸反应
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1、原理由于亚硝酸盐有氧化作用（有浓硫酸存在），可使二苯胺氧化，其氧化产物呈兰。
2、试剂二苯胺浓硫酸溶液：二苯胺0.1g加100 mL浓硫酸溶解后储存于棕瓶中。
3、操作方法取滤液1-2滴于点滴板上，加1-2滴二苯胺浓硫酸溶液，立即出现兰，证明有亚硝酸盐
存在。
注意要点：
1、亚硝酸盐在酸性条件下易分解，如送检不及时，夏天往往在死后第二天就不易检出。剩余饲料较易获
得阳性结果。
2、格林氏反应十分灵敏，反应很强烈时可以证明亚硝酸盐中毒，反应微弱时，需用灵敏度较小的方法进
行，一般要求两种以上方法都呈现阳性，才能证明亚硝酸盐中毒。同时需做空白对照，必要时可进行定量检验。
（二）亚硝酸盐的定量检验------α－萘胺比法
1、原理在微酸性条件下，亚硝酸盐与对氨基苯磺酸作用生成重氮化合物，再与α一萘胺偶合而生成紫黄
偶氮染料。颜强度与亚硝酸盐含量成正比。
2、试剂
飞盘制作
（1）α－萘胺溶液：同定性检验对氨基苯磺酸重氮法。
（2）对氨基苯磺酸溶液：同定性检验对氨基苯磺酸重氮法。
（3）亚硝酸钠标准液：准确称取0.1495g亚硝酸钠溶于水中，稀释至100mL。此液每mL相当于1mgNO2–。
临用时，精确吸取1.00mL，加水稀释至100mL。此液每毫升则相当手0.01mgNO2–。
（4）醋酸钠缓冲液：取16.4g醋酸钠溶于100mL水中。
3、操作方法
（1）取5－10g样品置研钵中，加少许玻璃砂和少许70℃水，研成粥状。分次加70℃左右热水提取，将上清液转入100mL容量瓶中。最后定容至刻度。（如颜深，可加少许活性炭脱），过滤，弃去最初几毫升滤液。
（2）吸取续滤液10mL于25mL比管中，加水至刻度。
（3）另取25mL比管7支，依次加入0,0.002,0.005,0.01,0.015,0.020,0.025mgNO2–.，加水稀释至刻度。
（4）于标准管和样品管中分别加入0.05mL醋酸钠缓冲液，对氨基苯磺酸液1mL，α—萘胺溶液1mL，摇匀。放置10分钟后，以零管作参比，用1cm比皿于波长525nm处测定吸光度，绘制工作曲线与之比较。
4、.结果计算
A
亚硝酸盐含量（mg／kg）＝包装内托
M/10
式中：A—样品管中测得含量，μg；M—称取样品量，g 。
六、作业
1、亚硝酸盐定性检验的方法有那些？其原理是什么？各有什么优缺点？
2、在亚硝酸盐可疑样品的定量检测中，要保证结果的准确，应注意那些问题？
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