作物学报ACTA AGRONOMICA SINICA 2008, 34(2): 192−197 /zwxb/ ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9E-mail: xbzw@chinajournal
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2008.00192
油菜cDNA表达文库构建及核盘菌致病因子互作蛋白的筛选和鉴定王心宇1,2杨恩东2戚存扣1,*陈松1张洁夫1杨清2 (1江苏省农业科学院, 江苏南京 210014; 2南京农业大学生命科学学院, 江苏南京 210095)
摘要：核盘菌 [S clerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary] 是引起油菜菌核病的病原真菌。核盘菌侵染植物细胞早期，可分泌一些细胞壁降解酶, 如不同类型的多聚半乳糖醛酸酶(polygalacturonase, PG)。这些酶对病菌在植物组织上的定植起关键作用, 同时酶活性的高低也决定病原菌的毒性或致病性。PG可以激活细胞的防卫反应而与其酶活性无关。为了解PG的信号转导途径, 利用RT-PCR方法克隆了核盘菌的PG基因, 将PG的编码区与酵母GAL4的DNA 结合功能区融合, 构建到酵母诱饵蛋白表达载体PGBKT7中; 然后在酵母中构建了油菜cDNA表达文库。通过酵母双杂交方法在油菜cDNA表达文库中对与PG互作的蛋白进行了筛选, 分离到一个与PG互作的蛋白, 测序及BLAST 分析表明该蛋白含有一个与钙离子结合的结构域, 称为C2结构域(C2-domain), 推测该蛋白是一种钙依赖的膜结合蛋白。该蛋白与拟南芥中一个含C2结构域功能未知蛋白的氨基酸同源性高达80.24%。利用半定量PCR分析了核盘菌诱导后该基因在油菜花、 茎、叶中的表达, 结果表明该基因在叶片中表达量最高。克隆到的C2蛋白与其他物种中的C2蛋白比较发现, 与钙离子结合的天冬氨酸残基很保守。
关键词: 核盘菌; 多聚半乳糖醛酸酶; C2结构域
手机应急充电器Construction of cDNA Expression Library of Oilseed Rape and Screen-ing and Identification of Interaction Partner of PG, A Virulence Factor from Sclerotinia sclerotiorum
WANG Xin-Yu1,2, YANG En-Dong2, QI Cun-Kou1,*, CHEN Song1, ZHANG Jie-Fu1, and YANG Qing2
(1 Academy of Jiangsu Agricultural Sciences, Nanjing 210014, Jiangsu; 2 College of Life Sciences, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, Jiangsu, China)
Abstract:Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary is the fungus that causes stem rot disease in oilseed rape. To overcome plant cell wall, during early pathogenesis, the fungus secretes several types of cell wall-degrading enzymes such as polygalacturonases (PGs). The activity of these enzymes is crucial for the colonization of plant tissues, and these enzymes can be determinants of pathogenicity or virulence. PG can activate defense reactions in plants, having no relation to the enzyme activity. I
n order to un-derstand PG signaling pathway, PG gene was cloned from Sclerotinia sclerotiorum by RT-PCR, the encoding region of PG was fused to the yeast GAL4 DNA-binding domain in yeast expression vector PGBKT7 and an oilseed rape cDNA expression library was constructed in yeast. PG-interacting proteins were screened in the library with PG as bait by yeast two-hybrid assay. An in-teracting protein was isolated, sequencing and BLAST analysis revealed that the protein contains a C2-domain and was predicted to be a Ca2+ binding domain. The protein shares 80.24% identity in amino acids with a C2-domain protein in Arabidopsis with unknown function. The expression levels of the C2-domain protein in floral, leaf and stem organs of oilseed rape were investi-gated by semi-quantitative RT-PCR, the results showed that the C2-domain protein was highly expressed in leaves after induced by Sclerotinia sclerotiorum. Comparison in C2-domain proteins between oilseed rape and other species suggested that aspartatic acid residues involving in Ca2+ binding were conserved.
Keywords:Sclerotinia sclerotiorum;Polygalacturonase (PG);C2-domain
基金项目：国家高技术研究发展计划(863计划)项目(2006AA10A112)
作者简介：王心宇(1965– ), 男, 博士, 副教授, 主要从事植物分子生物学教学及科研工作。E-mail: xywang@njau.edu *通讯作者(Corresponding author)：戚存扣, 研究员。E-mail: qck@jaas.ac
Received(收稿日期): 2007-06-11; Accepted(接受日期): 2007-09-20.
第2期王心宇等: 油菜cDNA表达文库构建及核盘菌致病因子互作蛋白的筛选和鉴定193
菌核病是由核盘菌 [S clerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary] 引起的一种严重的真菌性病害, 该病流行范围广, 遍及整个亚热带及温带地区。该病原菌寄主范围也很广泛, 能感染400多种不同的物种, 在农作物中主要浸染双子叶作物如豆类和油料作物[1]。大量研究证明, 油菜中核盘菌的抗源十分稀少, 不同品系间只是对菌核病的耐受性有差异, 而未发现高抗品种[2-3]。核盘菌属于腐生性病菌(necrotrophic pathogen), 感染寄主产生过敏性坏死反应(hypersensitive response, HR)或细胞程序性死亡(programmed cell death, PCD)不仅不利于寄主抵抗这种病菌, 反而有利于病菌的进一步侵染[4-5]。这种特性给菌核病的防治带来很大困难。
一些研究表明真菌分泌的草酸是核盘菌主要的致病因子。草酸可以酸化病菌感染部位, 与钙离子结合形成草酸钙沉淀[6]。近年来研究表明核盘菌分泌的多聚半乳糖醛酸酶基因(polygalacturonase, PG)在病菌感染植物过程中起非常重要作用。草酸可以降低环境pH, 为提高PG的酶活性及降解植物细胞壁创造有利条件。同时PG还具有致病因子的特性，如PG可诱导大豆细胞发生程序性死亡, 该过程是一个依赖于Ca2+的信号传递过程[7]。核盘菌可分泌不同类型的PG, 包括内切PG(endo-PGs)和外切PG(exo-PGs); 同一个PG基因的表达产物还能形成不同PG异构体, 这种现象可能是由于翻译后的修饰(posttran
slational, glycosylation)和(或)分泌后的修饰(post–secretional, proteolytic)过程所致; 不同PG 基因的的表达量差异很大, 核盘菌在感染寄主过程中表达量最高的一个PG基因称为sspg1d, 它与核盘菌的初始侵染以及致病性关系最为密切[8-9]。本研究克隆了sspg1d基因, 并将该基因克隆到酵母表达载体PGBKT7中, 构建成诱饵蛋白(Bait)表达载体, 通过酵母双杂交方法, 在核盘菌诱导油菜后构建的cDNA文库中, 筛选到一个含有钙离子结合功能区(即C2结构域)的基因, 暂命名为IPG-1。利用半定量PCR对该基因在不同器官中的表达水平做了初步研究。
1材料与方法
1.1材料
构建油菜cDNA文库所用的材料为对菌核病具有一定抗耐性的油菜品系宁RS-1, 由江苏省农科院经济作物研究所国家油菜工程分中心选育及提供。1.2方法
1.2.1核盘菌培养及RNA提取核盘菌菌株是从南京市油菜田中采集、培养和保存, 由江苏省农科院植保所提供。菌丝先接种于PSA(potato su-crose agar, 含potato extract 200 g L−1, sucrose 20 g L−1, agar 20 g L−1)固体培养基于20℃暗培养一周, 然后用手术刀将菌丝生长形成的平面切成0.5 cm的小方块, 接种于PS(potato sucrose, 含200 g L−1 potato extract, 20 g L−1, sucrose)液体培养基振荡培养5 d。用纱布收集菌丝后置−70℃保存备用。菌丝加液氮研磨, 用Trizol(购自Invitrogen公司)方法提取RNA。
1.2.2 核盘菌中PG基因克隆及诱饵蛋白表达载体构建对NCBI数据库中收集的PG基因L29040、L29041、L12023、AF501307、AF501308、AY312510进行序列对比分析, 根据ORF两端非常保守的区段, 设计一对引物: PG-F: 5'-ccatactgtctggtac attcac-3'和PG-R: 5'-tccagtgcttgaaagtagccga-3', 通过RT-PCR将PG基因克隆到T-easy vector(购自Promega公司)。根据PG基因ORF两端序列设计一对引物5'-ctctCATATGgttcacattctttcctcggcc-3'和5'-ctctCTGCAGttaacacttgacaccagatgg-3', 分别引入Nde I和Pst I酶切位点, 以含PG基因的T-easy载体作模板, PCR扩增后用Nde I和Pst I酶切, 即可将PG基因的ORF克隆到酵母表达载体PGBKT7的Nde I和Pst I位点之间, 构建成诱饵蛋白表达载体pBD/PG。测序由上海Invitrogen公司完成。
1.2.3 cDNA表达文库构建和双杂交筛选将旺盛生长的菌丝切成 5 mm方块接种油菜茎叶, 用封口模保湿。茎叶发病后取病斑周围健康组织用于RNA提取。用Trizol reagent (Invitrogen, USA)提取RNA。油菜cDNA文库构建和双杂交筛选采用Clontech公司的试剂盒Matchmaker TM Library Con-struction and Screening Kit的方法进行。
1.2.4半定量RT-PCR内标为真核生物翻译延伸因子(elongation factor 1-alpha, EF-1α), 引物序列为5'-agaccaccaagtactactgcac-3' (forward)和5'-ccacca atcttgtacacatcc-3' (reverse)。
2结果与分析
2.1 PG基因克隆及诱饵蛋白表达载体构建
加拿大学者Li等[8]从核盘菌cDNA文库中分离到6个PG基因, 其中4个为endo-PGs, 均为含ORF
194作物学报第34卷
的全长基因。另外2个exo-PGs为非全长基因序列。这6个基因均在NCBI中注册。本研究比对了其中4个全长endo-PG基因(编号为AF501307, AY496277, AF501308, AY312510)以及其他2个PG基因的DNA 序列(编号为L29040, L29041), 发现这些基因的ORF两侧序列非常保守, 所以根据这一特征设计了
图1本研究克隆到的PG基因与Li等克隆的PG基因(sspg1d) N
端氨基酸序列比对
Fig. 1 Comparison of deduced N-terminal amino acid sequences of PG cloned in the present study with sspg1d cloned by Li et al.
图2通过同源重组构建cDNA与酵母GAL4转录激活功能域(AD)融合的表达文库
Fig. 2 Constructing AD fusion libraries by recombination-mediated cloning in yeast
用PCR方法在cDNA两端分别引入BD SMART III和CDS III接头, 将含有接头的cDNA及Sma I线性化的酵母表达载体pGADT7-Rec 或pGADT7-Rec2共转化酵母细胞后, 在酵母细胞修复酶的作用下, cDNA即可与表达载体发生同源重组形成环状质粒。pGADT7-Rec 用于构建双杂交文库, pGADT7-Rec2用于构建单杂交文库, 这两个载体上均含酵母GAL4转录激活功能域(AD)。
To clone cDNA into pGADT7-Rec or pGADT7-Rec2, cotransform yeast with ds cDNA (generated with our modified BD SMART procedure) and either pGADT7-Rec (two-hybrid screen) or pGADT7-R
ec[2] (one-hybrid screen). Yeast repair enzymes will restore the Sma I-linearized plasmid to its circular form by recombining sequences at the ends of the cDNA with homologous sequences at the ends of pGADT7-Rec[2].
The outcome is a fully functional GAL4 AD/cDNA expression vector.
一对引物, 经过RT-PCR及克隆、测序和序列对比证明克隆到了其中一个PG全长基因, 共编码380个氨基酸。经序列比对发现, 该基因与Li等克隆的PG 基因sspg1d(NCBI编号为AF501307)的氨基酸序列几乎相同, 仅在N端第3位氨基酸存在差异(图1)。这种变化可能是中国南京收集的核盘菌与加拿大收集的核盘菌发生变异所致。极高的序列相似性证明我们克隆到了sspg1d基因。Li等证明sspg1d在核盘菌侵染寄主时表达量最高, 与病菌致病性关系最密切。本研究用克隆到的这个基因作为诱饵蛋白筛选寄主中的互作因子来研究核盘菌−油菜互作过程中的有关协作蛋白。用1.2.4方法构建成诱饵蛋白表达载体pBD/PG。客户通讯录管理系统
2.2 cDNA表达文库构建
用核盘菌接种油菜茎、叶部位, 发病后取病斑周围健康组织, 提取RNA并逆转录为第一链cDNA, 通过RT-PCR扩增产生双链cDNA(ds cDNA), 同时在其两端引入可与线性载体pGADT7-Rec发生同源重组的序列BD SMART III和CDS III(如图2所示)，用ds cDNA及线性载体pGADT7-Rec共转化酵母菌株AH10
9后, ds cDNA即可在酵母细胞内与线性载体pGADT7-Rec发生同源重组, 进而形成环状包含cDNA的pGADT7质粒, 这样便在酵母中构建好cDNA表达文库。经统计, 文库容量为1.3×106, 符合试剂盒对库容量的要求, 足以满足筛选文库的需要。
图3以PG为诱饵在文库中筛选到的阳性克隆Fig. 3 Interaction between PG and C2-domain protein re-
vealed by yeast two-hybrid assay
该阳性克隆与PG的互作在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp并涂有中药煎药器
X-α-Gal的四缺培养基上得到进一步证实。测序及BLAST分析表明该阳性克隆为含C2结构域蛋白。箭头所示两个区域为两次重复试验, 含pBD/PG及pAD/C2基因质粒的酵母细胞可以在涂有X-α-Gal的SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp四缺培养基上生长并变蓝。
Two repeat experiments were performed as arrow showed. The yeast diploid cells produced by mating Y187 (containing pBD/PG plasmid) and AH109 (containing C2-domain protein) can grown on SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp medium and turn blue when spreading
X-α
高频电子水处理器
-Gal on plates.
第2期
王心宇等: 油菜cDNA 表达文库构建及核盘菌致病因子互作蛋白的筛选和鉴定 195
2.3 文库筛选和阳性克隆的鉴定
将PGBKT7-PG 转化酵母菌株Y187, cDNA 文库已转化到酵母AH109菌株中。利用酵母菌株Y187与 AH109交配(Mating)方法筛选油菜cDNA 文库。第一轮筛选在三缺培养基SD/-His/-Leu/-Trp 中进行, 筛选到的阳性克隆在四缺培养基SD/-Ade/-His/-Leu/ -Trp 并涂有X-α-Gal 上划线进一步确认是否为真正的阳性克隆。经过上述严格筛选, 最后仅筛选到一个阳性克隆, 如图3所示。从该阳性克隆中提取质
粒, 然后转化大肠杆菌DH10B, 经筛选、测序获得了一个基因片段, 经BLAST 分析, 该片段包含一个保守的结构域, 被称为“C2结构域”(C2 domain)。通过RACE 方法, 我们成功克隆了该基因的全长, 共编码168个氨基酸, 将该基因定名为IPG-1。BLAST 分析表明该蛋白N 端1~89氨基酸为C2结构域, C 端90~168氨基酸可能主要与蛋白-蛋白互作有关。IPG-1与拟南芥中一个含C2结构域功能未知蛋白的氨基酸同源性高达80.24%(图4)。
图4 推导的IPG-1氨基酸序列与一个功能未知的拟南芥C2蛋白(NP198590)同源性比较
Fig. 4 Alignment of deduced amino acid sequences of IPG-1 and an Arabidopsis C2-domain gene (NP198590) with unknown function
2.4 IPG-1在不同器官中的表达分析
利用半定量RT-PCR 分析IPG-1基因在油菜茎、叶、花(蕾)中的表达如图5所示, 以翻译延伸因子EF-1α作为内标, 发现在核盘菌诱导油菜茎和叶后, 叶片中IPG-1的表达量最高, 其次为茎, 花(蕾)中表达量最低。
图5 用半定量PCR 分析核盘菌诱导油菜后IPG-1在茎、叶、花中的表达
Fig. 5 Expression of IPG-1 in different organs analyzed by semi-quantitative RT-PCR with eukaryotic elongation factor
1-alpha (EF-1α)gene as internal control 内对照为真核生物翻译延伸因子EF-1α。彩钢板屋顶
F: floral organ; L: leaf; S: stem.
2.5 IPG-1与其他含C2结构域基因的序列比较
目前在高等动物及人类中发现的含C2结构域
的蛋白一般包含1~3个C2结构域, 而植物中发现的这类蛋白只包含一个C2结构域, 而且这类基因除与Ca 2+结合的位点及其他少数几个位点比较保守外, 不同基因间序列差异很大。将克隆到的IPG-1与人类、动物和植物中的C2结构域分别做了氨基酸序列比对, 如图6和图7所示。与动物及人类的C2结构域
比较, IPG-1与其他基因间氨基酸序列差异很大, 但有3个很保守的天冬氨酸残基(D); IPG-1与来源于植物的C2结构域比较, 其序列相似性较高, 且有5个很保守的天冬氨酸残基(D)。已有研究表明这些保守的天冬氨酸残基可能是Ca 2+结合位点[10]。
3 讨论
已有研究表明, 在一些真菌中, PG 与致病性关系非常密切, 即具有致病因子的功能。Shieh 等[11]证明在黄曲霉不同类型中, 表达PG 基因的类具有很高的毒性, 而不表达PG 基因的类则不具致病性; Have 等[12]用遗传学方法证明在灰霉病菌中, 表达PG 基因的菌株有很高致病性, 而PG 突变体虽
196作物学报第34卷
图6 IPG-1与来源于人、牛、鼠的C2结构域的比对
Fig. 6 Comparison of deduced amino acid sequences of IPG-1 with C2-domains from human PKCα(amino acid residues 167–267, P17252), human cPLA2 (residues 17–113, M72393), bovine PLCδ1 (residues 569–666, P10895), and rat Synl-A, synaptotagmin I C2A
(residues 152–251, P21707) proteins
PKCα为人蛋白激酶(NCBI编号, P17252), 截取其含C2结构域167~267氨基酸段; cPLA2为人磷脂酶(NCBI编号, M72393)，截取含C2结构域17~113氨基酸段; PLCδ1为牛磷脂酶(NCBI编号, P10895), 截取其含C2结构域569~666氨基酸段; Synl-A为鼠突触结合蛋白(NCBI编号, P21707), 截取其含C2结构域152~251氨基酸段。保守的氨基酸残基以黑背景表示, 其中包括3个推测与Ca2+结合
的天冬氨酸残基D。
The most conserved amino acid residues are shown in black, including three putative Ca2+-binding aspartatic acid residues (D).
然能感染植物, 但丧失了扩展能力; Zuppini等[7]用核盘菌PG蛋白处理大豆悬浮细胞, 引起细胞内Ca2+浓度迅速提高, 并很快诱导大豆细胞发生程序性死亡(PCD), 证明该过程是钙依赖的信号传递过程, Ca2+在PG信号传递中具有重要作用。本研究以核盘菌PG为诱饵蛋白, 在油菜cDNA文库中筛选到
一个含C2结构域的蛋白, 而已有研究表明C2结构域可与Ca2+结合[10,14-15], 暗示Ca2+很可能以某种方式参与了PG的信号传递过程。PG与C2蛋白的结合有何生物学意义还需做进一步研究。
miankongqu越来越多的证据表明蛋白质模块(protein mod-ules)或称为结构域(domain)或功能区广泛存在于自然界的各种蛋白质分子中。目前已发现很多蛋白质模块, 如C2、SH2、PTB、PH、SH3、WW及PDZ 等。这些模块可以独立折叠, 由80~160个氨基酸构成, 具有各种各样的功能。已有研究表明大部分含C2结构域的蛋白是钙依赖性的磷脂结合蛋白。含该结构域的蛋白主要与信号转导以及细胞膜运动(membrane traffic)有关[12]。含C2结构域的蛋白首先在高等动物蛋白激酶C(protein kimase C)中发现[13]。之后陆续在人类及高等动物中发现100个左右含C2结构域的蛋白, 如突触结合蛋白(synaptotagmin), 磷酯酶A2(phospholipase A2), 磷脂酶C(phospholipase C), GTP酶激活蛋白(GTPase activating proteins)等, 这些蛋白的功能多种多样, 如参与磷脂第二信号产生(generation of lipid-second messengers)、GTP酶的激活、控制蛋白质磷酸化以及参与蛋白−蛋白互作等。人类及动物中发现的含C2结构域的蛋白一般包含1~3个C2结构域[14]。在植物中已报道的含C2结构域的蛋白仅有少数几例, 且仅含一个C2结构域, 被称为小C2结构域蛋白(small C2-domain protein), 如在水稻中发现的OsERG1a和OsEGG1b, 当水稻细胞受真菌激发子诱导后, 这两个蛋白可从细胞质运动到细胞膜[15]; 在大麦中发现的HvC2d, 是一个受重金属诱导表达或在衰老叶片中表达的C2结构域基因[16]; 拟南芥中发现的BAP1, 在其抗病反应中起负调控作用[17]。本研究从油菜中分离到一个含C2结构域的基因。一方
面阐明了PG和含C2结构域蛋白存在互作关系, 同时也表明PG除有降解细胞壁的功能外, 还具有参与蛋白互作的功能。另一方面为PG作为致病因子的信号传递途径提供了一些线索。我们已经构建了IPG-1过量表达和RNAi植物
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
关于我们
投诉建议