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标题：国内外的黄曲霉毒素测定法黄 曲 霉 毒 素 具 有 较 强 的 毒 害 作 用 ， 可 诱 发 肝 、 肾 、 肺 、 胃 等 部 位 的 癌 变 ， 黄 曲 霉毒 素 B1 被 公 认 为 是 目 前 致 癌 力 最 强 的 天 然 物 质 。药 材 、 饮 片 及 制 剂 在 贮 藏 、 制 备 、 运 输 过 程 中 ， 如 保 存 不 当 ， 就 会 有 受 潮 霉 变 而污 染 黄 曲 霉 毒 素 的 可 能 。因 此 ， 各 药 典 都 将 黄 曲 霉 毒 素 列 为 很 重 要 的 安 全 性 指 标 ， 中 国 药 典 和 欧 洲 药 典 对多 种 中 药 材 都 都 建 立 了 黄 曲 霉 素 检 查 指 标 ， 美 国 药 典 对 植 源 性 的 药 品 也 要 求 检 查黄 曲 霉 毒 素 。
今 天 小 编 就 详 细 介 绍 中 国 药 典 、 欧 洲 药 典 和 美 国 药 典 的 黄 曲 霉 毒 素 测 定 方 法 ， 总结 出 各 药 典 的 差 异 ， 并 列 出 详 细 的 检 验 方 法 ， 供 各 位 参 考 。1、 比 较 中 国 药 典 、 美 国 药 典 、 欧 洲 药 典 的 检 查 方 法对 比 内容 中 国 药 典 美 国 药 典 欧 洲 药 典依 据 通 则 2351真 菌 毒 素测 定 法 GENERAL CHAPTERS<561> 2.8.18 DETERMINATION OFAFLATOXIN B1 IN HERBAL DRUGS
方法 第一法 HPLC法 TLC法 HPLC法第二法 HPLC-MS法 薄 层 扫 描 法第三法 酶 联 免 疫 法 HPLC法限 度 每 1000g含 黄 曲 霉 毒素 B1不 得 过 5μg ，总 量 不 得 过 10μg。 每 1000
g含 黄 曲 霉 毒 素 B1不 得 过 5μg， 总 量 不 得 过20μg。 每 1000g含 黄 曲 霉 毒 素 B1不 得过 2μg， 总 量 不 得 过 4μg。说 明 中 国 药 典 的 三 种 方法 都 可 以 使 用 ， 当 测 首 先 使 用 第 一 法 ， 第 一 法系 统 适 用 性 不 通 过 才 会 使 只 有 一 种 方 法 ， 适 用 于 devil''s claw root, ginger and
视频处理定 结 果 超 出 限 度 时 ，采 用 第 二 法 进 行 确认 。 用 第 二 法 或 第 三 法 。 senna pods， 用 于 其 他 品 种 需要 验 证 适 用 性 。注 ： 总 量 为 黄 曲 霉 毒 素 B1（ AFB1） 、 黄 曲 霉 毒 素 B2（ AFB2） 、 黄 曲 霉 毒 素 G1（ AFG1）和 黄 曲 霉 毒 素 G2（ AFG2） 的 总 量 。2、 详 解 中 国 药 典 、 美 国 药 典 、 欧 洲 药 典 的 HPLC 方 法黄 曲 霉 毒 素 检 查 方 法 中 ， 唯 一 同 时 适 用 于 三 家 药 典 的 方 法 ， 只 有 HPLC 法 （ 荧 光 检测 器 ） ， 而 且 光 化 学 检 测 器 与 HPLC-荧 光 检 测 器 配 套 使 用 ， 在 线 对 黄 曲 霉 毒 素 B1、G1 进 行 衍 生 ， 不 需 要 任 何 化 学 试 剂 ， 应 用 范 围 较 广 ， 因 此 本 文 重 点 比 较 此 法 在 各
药 典 中 的 异 同 。从 以 下 几 部 分 可 以 看 出 ， 谱 柱 、 流 动 相 、 流 速 、 波 长 、 供 试 品 和 对 照 品 的 配 制方 法 、 进 样 量 等 内 容 都 存 在 较 大 差 异 ， 需 要 谨
慎 对 照 使 用 。本 文 详 细 写 出 了 USP 中 的 几 种 测 定 方 法 。2.1 中 国 药 典 中 黄 曲 霉 毒 素 检 查 方 法 （ HPLC 法 ）检 验方 法 具 体 内 容 谱柱
十 八 烷 基 硅 烷 键 合 硅 胶 为 填 充 剂流 动相 甲 醇 -乙 腈 -水 (40 : 18 : 42)流 速 1.0mL/min柱 后衍 生化 光 化 学 衍 生 器 （ 254nm）检 测器 荧 光 检 测 器 ， 激 发 波 长 360nm (或 365nm)， 发 射 波 长 450nm。系 统适 用性 两 个 相 邻 谱 峰 的 分 离 度 应 大 于 1.5； 需 确 认 回 收 率 应 在 60~120%， 线 性 回 归 的 相 关
系 数 应 不 低 于 0.990；混 合对 照 精 密 量 取 黄 曲 霉 毒 素 混 合 对 照 品 溶 液 （ 黄 曲 霉 毒 素 B1、 B2、 G1、 G2 标 示 浓 度 分 别 为1.0μg/mL、 0. 3μg/mL、 1.0μg/mL、 0.3μg/mL） 0.5mL， 置 10mL量 瓶 中 ， 用 甲 醇 稀 释
营养块
品 溶液 至 刻 度 ， 作 为 贮 备 溶 液 。 精 密 量 取 贮 备 溶 液 1mL， 置 25mL量 瓶 中 ， 用 甲 醇 稀 释 至 刻度 ， 即 得 。供 试品 溶液 取 供 试 品 粉 末 约 15g（ 过 二 号 筛 ） ， 精 密 称 定 ， 置 于 均 质 瓶 中 ， 加 入 氯 化 钠 3g， 精密 加 入 70%甲 醇 溶 液 75mL, 高 速 搅 拌 2 分 钟 （ 搅 拌 速 度 大 于 11000 r/min） ， 离 心 5分 钟 （ 离 心 速 度 4000r/min） ， 精 密 量 取 上 清 液 15mL, 置 50mL量 瓶 中 ， 用 水 稀 释 至刻 度 ， 摇 匀 ， 离 心 10分 钟 （ 离 心 速 度 4000r/min)， 精 密 量 取 上 清 液 20mL， 通 过 免疫 亲 合 柱 ， 流 速 每 分 钟 3mL, 用 水 20mL洗 脱 (必 要 时 可 以 先 用 淋 洗 缓 冲 液 10mL 洗 脱 ，再 用 水 10mL洗 脱 ） ， 弃 去 洗 脱 液 ， 使 空 气 进 人 柱 子 ， 将 水 挤 出 柱 子 ， 再 用 适 量 甲 醇洗 脱 , 收 集 洗 脱 液 ， 置 2mL 量 瓶 中 ， 加 甲 醇 稀 释 至 刻 度 ， 摇 匀 ， 用 微 孔 滤 膜 (0. 22μm)滤 过 ， 取 续 滤 液 ， 即 得 。进 样量 混 合 对 照 品 溶 液 5μl、 10μl、 15μl、 20μl、 25μl； 供 试 品 溶 液 20~50μl。定 量
方 法 测 定 各 对 照 品 溶 液 的 峰 面 积 ， 以 峰 面 积 为 纵 坐 标 ， 以 进 样 量 为 横 坐 标 ， 绘 制 标 准 曲线 ； 测 定 供 试 品 溶 液 的 峰 面 积 ， 从 标 准 曲 线 上 读 出 供 试 品 中 黄 曲 霉 毒 素 B1、 B2、 G1、G2的 量 ， 并 计 算 出 四 者 总 和 。2.2 美 国 药 典 中 黄 曲 霉 毒 素 检 查 方 法 （ HPLC 法 ）检 验方 法 具 体 内 容 谱柱 4.6-mm× 15 cm， 3-μm 填 料 L1（ 即 十 八 烷 基 硅 烷 键 合 硅 胶 ）流 动相 水 -甲 醇 -乙 腈 （ 60:25:15）流 速
0.8 mL/min柱 后衍 生化 光 化 学 衍 生 器 （ 254nm）检 测器 荧 光 检 测 器 ， 激 发 波 长 362nm， 发 射 波 长 440nm系 统适 用性 洗 脱 顺 序 为 AFG2、 AFG1、 AFB2和 AFB
1；将 5 号 线 性 对 照 溶 液 5mL加 入 到 5g 的 样 品 中 ， 按 “ 供 试 品 溶 液 ” （ 甲 醇 -0.5%碳 酸氢 钠 （ 7:3） 用 量 为 20mL） 处 理 方 法 ， 计 算 AFB1（ 2μ g/kg） 和 黄 曲 霉 毒 素 （ 5μ g/kg）的 平 均 回 收 率 ， 应 分 别 不 低 于 68%和 70%。 AFB1和 黄 曲 霉 毒 素 总 量 的 相 对 标 准 偏 差（ RSD） 不 高 于 10%。免 疫
亲 和 免 疫 黄 曲 霉 素 柱 的 总 黄 曲 霉 毒 素 最 小 容 量 不 低 于 100ng。 将 AFB1、 AFB2、 AFG1和AFG2每 个 5ng， 溶 于 10mL 10%甲 醇 的 磷 酸 盐 缓 冲 盐 溶 液 （ v/v） 中 时 ， 各 回 收 率 不半导体模块
3600c柱 预处 理 低 于 80%。对 照品 溶液 用 乙 腈 制 备 AFB1、 AFB2、 AFG1和 AFG2分 别 含 有 2.0、 0.50、 2.0和 0.50μ g/mL的混 合 对 照 溶 液 。 首 先 用 乙 腈 制 备 标 示 浓 度 均 为 10μ g/mL 的 各 储 备 液 ， 在 360nm 附近 测 定 最 大 吸 光 度 ， 计 算 公 式 为 ： 黄 曲 霉 毒 素 浓 度 （ μ g/mL） =（ A× Mr× 1000） /ε ，其 中 A 为 吸 光 度 ， Mr为 分 子 量 ， ε 为 摩 尔 吸 收 系 数 ， 见 附 表 1。 准 确 量 取 一 定 量 黄曲 霉 毒 素 各 储 备 液 至 同 一 容 量 瓶 ， 用 乙 腈 稀 释 至 规 定 浓 度 。 冰 箱 储 存 ， 使 用 前 平 衡至 室 温 。 用 甲 醇 - 水 （ 1:1） 稀 释 黄 曲 霉 素 对 照 溶 液 ， 最 终 浓 度 见 附 表 2。 冰 箱 保存 ， 使 用 前 平 衡 至 室 温 ， 每 日 新 制 。
电机风叶供 试品 溶液 取 样 品 5g， 置 于 50mL离 心 管 中 ， 加 入 氯 化 钠 1 g 和 甲 醇 - 0.5%碳 酸 氢 钠 （ 7:3）25 mL。 在 涡 流 混 合 器 上 混 合 ， 直 到 样 品 颗 粒 和 提 取 溶 剂 充 分 混 合 ， 400 rpm振 摇10min， 7000 rpm离 心 10min， 立 即 取 7 mL至 50 mL离 心 管 中 ， 加 入 0.1 M 磷 酸 盐缓 冲 溶 液 28 mL， 混 合 ， 过 滤 ， 收 集 25mL滤 液 （ 相 当 于 1g样 品 ） 到 25mL 刻 度 量 筒中 ， 并 立 即 上 IAC柱 。 [注 ： 对 于 IAC 柱 在 使 用 前 必 须 在 室 温 下 至 少 平 衡 15分 钟 。 ]从 小 柱 上 取 下 顶 盖 ， 并 将 其 与 储 液 罐 连 接 。 从 柱 上 拆 下 端 盖 ， 并 将 其 连 接 到 柱 歧 管上 （ 必 须 拧 紧 ） 。 让 柱 中 的 液 体 通 过 ， 直 到 液 体 高 出 柱 床 约 2~3 mm。 将 滤 液 25mL倒 入 储 液 罐 。 让 液 体 自 然 流 过 柱 子 ， 让 柱 子 流 干 。 为 了 便 于 再 次 开 始 流 动 ， 从 歧 管上 取 下 谱 柱 ， 向 柱 中 加 入 磷 酸 盐 缓 冲 盐 溶 液 约 2mL， 将 谱 柱 重 新 连 接 到 储 液 罐上 ， 然 后 用 磷 酸 盐 缓 冲 盐 溶 液 3mL和 水 5mL清 洗 谱 柱 （ 如 果 使 用 其 他 技 术 去 除 柱末 端 的 气 泡 并 很 容 易 重 新 开 始 流 动 ， 则 可 将 磷 酸 盐 缓 冲 盐 溶 液 5mL直 接 加 入 到 柱 储液 罐 中 ） 。 让 柱 子 流 干 ， 然 后 用 注 射 器 注 入 3mL空 气 通 过 柱 子 ， 用 甲 醇 1mL洗 脱 ，并 用 3mL 容 量 瓶 中 收 集 洗 脱 液 ， 使 洗 脱 液 自 由 滴 落 。 让 柱 子 流 干 。 静 置 1分 钟 ， 然后 用 额 外 的 甲 醇 1mL洗 脱 ，
并 收 集 在 同 一 容 量 瓶 中 。 让 柱 子 流 干 ， 并 注 入 10mL 空气 通 过 柱 子 ， 用 水 稀 释 洗 脱 液 至 刻 度 ， 立 即 进 行 分 析 。进 样量 50μl定 量
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