[实验目的]
1、掌握细菌分离培养及移植的基本要领和方法。
[实验原理]
在细菌学诊断中，分离培养是不可缺少的一环。分离培养的目的主要是在含多种细菌的病料或培养物中挑选出某种细菌。在分离培养时应注意：选择适合于所分离细菌生长的培养基、培养温度、气体条件等。同时应严格按无菌操作程序进行实验，并做好标记。 [实验材料]
菌种：大肠杆菌斜面、大肠杆菌与金黄葡萄球菌等。
器械：剪刀、记号笔(以上小组共用)。
培养基：普通肉汤和普通琼脂斜面、普通琼脂平板、酒精灯、接种环。
[实验内容]
1、细菌的分离
平板划线接种法 通过在平板上划线，将混杂的细菌在琼脂平板表面充分的分散开，使单个细菌能固定在一点上生长繁殖，形成单个菌落，以达到分离纯种的目的。若需从平板上获取纯种，则挑取一个单个菌落作纯培养。可用做分离纯种细菌。 操作方法（三区划线法）：
a、右手拿接种环，烧灼冷却后，勾取菌种。
b、左手抓握琼脂平板（让皿盖留于桌上），在酒精灯火焰左前上方，使平板面向火焰，以免空中杂菌落入，右手将已沾菌的接种环在琼脂表面密集而不重叠的来回划线，面积约占整个平板的1/5-1/6，此为第一区。划线时接种环与琼脂呈30-40度角轻轻接触，利用腕力滑动，切忌划破琼脂。
c、接种环上多余的细菌可烧灼（每划完一个区域是否需要烧灼灭菌视标本中含菌量多少而
定），待冷后，在划线末端重复2-3根线后，再划下一区域（约占1/4面积），此为第二区。
d、第二区划完后可不烧灼接种环，用同样方法划第三区，划满整个平皿。
e、划线完毕，将平板扣入皿盖并作好标记，置37℃温箱孵育18-24小时观察琼脂表面菌落分布情况，注意是否分离出单个菌落，并记录菌落特征（如大小、形状、透明度、素等）。
平板分区划线法 培养后菌落分布情况
平板划线培养的方法甚多，可按各人的习惯选择应用，其目的都是达到使被检材料适当的稀释，以求获得独立单在的菌落，防止发育成菌苔，以致不易鉴别其菌落性状。划线培养时须注意以下几点：标志验证
a.整个操作过程中应严格无菌操作。
b.划线前先将接种环稍稍弯曲，这样易和平皿内琼脂面平行，不致划破培养基。
c.划线中不宜过多地重复旧线，以免形成菌苔。
d. 接种完毕后在皿底作好菌名、日期和接种者等标记，平皿倒扣，置37℃培养。
2、细菌的培养
需氧性细菌的培养 根据细菌的生长特性给于合适的生长环境。大多数嗜体温菌及病原菌均能在37℃，18-24h生长良好。
3、细菌的移植
将划线分离培养37kkrrrr℃ 24h的平板从温箱取出，挑取单个菌落，经染镜检，证明不含杂菌，此时用接种环挑取单个菌落，移植于琼脂斜面培养，得到的培养物，即为纯培养物，再作其他各项试验检查和致病性试验等。具体操作方法如下：
(1)两试管斜面移植时，左手斜持菌种管和被接种琼脂斜面管，使管口互相并齐，管底部放在拇指和食指之间，松动两管棉塞，以便接种时容易拔出。右手持接种棒，在火焰上灭菌后，用右手小指和无名指并齐同时拔出两管棉塞，将管口进行火焰灭菌，使其靠近火焰。将接种环伸入菌种管内，先在无菌生长的琼脂上接触使之冷却，再挑取少许细菌后拉出接种环立即伸入另一管斜面培养基上，勿碰及斜面和管壁，直达斜面底部。从斜面底部开始划曲线，向上至斜面顶端为止，管口通过火焰灭菌，将棉塞塞好。接种完毕，接种环通过火焰灭菌后放下接种棒。最后在斜面管壁上注明菌名、日期和接种者，置37℃温箱中培养。
(2)从平板培养基上选取可疑菌落移植到琼脂斜面上作纯培养时，则用右手执接种棒，将接种环火焰灭菌，左手打开平皿盖，挑取可疑菌落，左手盖上平皿盖后立即取斜面管，按上述方法进行接种、培养。
(3)从斜面接种到液体培养基 将已取有菌种的接种环伸入到液体培养基中,并使环在液体与管壁接触的部位轻轻摩擦,使菌体分散于液体中。接种后塞上棉塞,将液体培养基轻轻晃动,使菌体均匀分布于液体中,以利生长。
(4)从液体接种到液体培养基 需用无菌移液器、移液管或吸管等。本实验室常用吸管。取无菌吸管，除去上部包装纸，在上端管口加橡皮头，拔出管口棉塞，在火焰旁伸入菌种管内，吸取菌液，转接到待接种的液体培养基内。烧灼管口，塞好棉塞，进行培养。10 18 100 101
(5)液体接斜面 方法同（1）
(6)半固体移植用穿刺法接种 方法基本上与纯培养接种相同，不同的是用接种针挑取菌落，垂直刺人培养基内。要从培养基表面的中部一直刺入管底，然后按原方向退出即可。
[实验结果预测]
采用划线接种培养皿里有单菌落出现，这说明划线接种能达到分离培养的目的。
平板分离培养分离到两种菌落：
活顶尖
大肠杆菌菌落：扁平、宽大、无素。 金黄葡萄球菌菌落：小而凸。
需氧性细菌在37℃下，培养18-24h生长状况良好。
细菌移植后在培养基中生长特性的观察：
1、琼脂平板培养基 主要观察细菌在培养基上形成的菌落的特征。
(1)大小 以直径(mm表示），小菌落如针尖大，大菌落为5~6mm甚至更大。
(2)形状 有圆形、不规则形、针尖状、露滴状、同心圆形、根足形等。
(3)边缘 有整齐、波浪状、锯齿状、卷发状等。空气雨伞
(4)表面形状 光滑、粗糙、同心圆状、放射状、皱状、颗粒状等。
(5)湿润度 湿润、干燥。
(6)泽和透明度 泽有无、白、黄、橙、红等；透明度有透明、半透明、不 透明等。
(抽油机模型7)质地 分坚硬、柔软或黏稠等。
2、肉汤培养基
(1)浑浊度 有高度浑浊、轻微浑浊或仍保持透明者。
(2)沉淀 管底有无沉淀，沉淀物是颗粒状或棉絮状等。
(3)表面 液面有无菌膜，管壁有无菌环。
(4)泽 液体是否变，如绿、红等。
3、半固体培养基
具有鞭毛的细菌，沿穿刺线向周围扩散生长，无鞭毛的细菌沿穿刺线呈线状生长。
[实验分析]
划线培养整个操作过程中应严格无菌操作。划线前先将接种环稍稍弯曲，这样易和平皿内琼脂面平行，不致划破培养基。划线中不宜过多地重复旧线，以免形成菌苔。接种完毕后在皿底作好菌名、日期和接种者等标记，以便辨别记录，之后平皿倒扣，置37℃培养。
[实验改进意见]
（1）第一区划线时，接种环勾取细菌不宜太多。
（2）划线时线条尽量不要重复，保证划线过程应是越来越少。
（3）制备培养基时，加入琼脂量要稍多，使培养基硬度增加，接种环换面也要处理平整甚至稍稍上翘，并在接种时把握好力度，控制好接种环环面和培养基表面角度，使其尽可能平行，以防止平板被划烂。
[思考题]
1、在平板划线法中，为什么每次都需要将接种环上的剩余物烧掉？
这么做的主要目的是杀死上次划线后接种环上残留的菌种，以使下次划线的菌种直接来自于上次划线的末端，使每次划线菌种数目减少，从而达到分离菌株的目的。
2、为什么要把培养皿倒置培养？
操作时培养皿盖上可能粘有水珠或者细菌，倒着培养可以避免培养皿盖上的水珠或者微生物落在培养皿上；培养过程中，细菌在代谢繁殖过程中会产生一些有害于细菌生长繁殖的代谢物，释放热量及有水排出，如果不倒着培养会有水珠滴落到培养基中，影响菌落的生长；如果培养目标是收集细菌代谢物，而且代谢物易溶于水，倒着培养可能会方便收集。
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