核酸的纯化
注意：在注有处材料的正确使用参见附录12。
在分子克隆的所有操作中，最基本的操作也许要算核酸的纯化了。其关键步骤是去除蛋白质，通常只要用酚：氯仿和氯仿抽提核酸的水溶液即可。每当在进行下一步操作之前需要把这一步克隆操作所用的酶灭活并去除时，都可采用这种抽提的方法。然而如果要从各种复杂分子的混合物如细胞裂解液中纯化核酸，则需一些附加办法。在这些情况下，通常是在有机溶剂抽提之前先用某些蛋白水解酶去掉大部分蛋白质，这些广谱的蛋白水解酶包括链霉蛋白酶及蛋白酶K(见附录4，表 A4-8)。
用酚：氯仿抽提
从核酸溶液中去除蛋白质的标准方法是先用酚：氯仿(可含有0.1%的8-羟基喹啉)抽提后再用氯仿抽提。这个方法的好处是使用两种不同有机溶剂去除蛋白质比用单一有机溶剂效果更佳。此外，酚虽能有效地使蛋白质变性，却不能完全抑制RNA酶的活性，酚还能溶解带有长poly(A)的RNA分子(Brawerman et al.1972)。用酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)混合液抽提能够使这两个问题同时得以解决。随后用氯仿抽提则可去除残留在核酸制品中痕量的酚。通过乙醚抽提去除酚已广泛沿用多年，看来在目前的常规操作中已不必要或者不推荐使用。
(1)将样品转移到一只聚丙烯离心管中，加入等体积的酚：氯仿。
如果酚未被充分平衡至pH值为7.8-8.0，核酸将趋于分配到有机相。
(2)混合管中的内容物使之成为乳浊液。
(3)室温下用离心管可承受最大转速的80%的速度离心1min，若有机相与和水相不能充分分 开，延长时间重新离心。
一般情况下水相处于上层，然而当水相中盐浓度(>0.5mol/L)或蔗糖浓度(>10%)过高而密度较大时，水相可能会在下层。由于在平衡酚时加了8-羟基喹啉(见附录1)，其黄颜可使有机相易于辨别。
(4)用移液管把水相转移到另一离心管中，体积较小(<200ul)时可用带一次性吸头的自动移液
器操作。弃去两相间的界面层和有机相。
为了获得最高的收率，可按下法对有机相和介面层进行“回提”：按上述方法第一次移出水相后，在剩余的有机相和介面层中加入等体积TE(PH7.8)，充分混匀，按第3步离心分离两相，合并
两次得到的水相，继续按第5步操作。
(5)重复1～4步，直55有机相和水相之间的界面上看不到蛋白质。
开口料(6)加入等体积的氯仿并重复2～4步。
偶尔也使用乙醚从高分子质量DNA制品中去除痕量的氯仿(见下面的加注)。
[注]有机相与水相的混合，在分离小分子DNA(<10kb)时可使用旋涡混合器，分离中等大小DNA分子(10--30kb)时可轻轻摇动，而当分离大分子(>30kb)时则须注意以下事项，以避免对DNA的剪切作用(可参见第6章)。
i在转鼓上缓慢转动(20r/mm)离心管，使有机相与水相混匀。
ii将DNA从一管转移到另一管时应使用大口径吸管。
关于酚(C6H6O，F.W.=94.11)抽提的历史小记
直到20世纪50年代，纯化DNA的标准操作方法还是用去污剂和强盐(如高氯酸盐)溶液从蛋白质上脱下核酸，最终去除蛋白是用含有异戊醇的氯仿多次抽提实现的(Sevag 1934，Sevag et al.1938)。利用酚
电能计量接线盒
纯化核酸是Kirty首次报道的(1956)，这时他得知酚具有从水相中抽提蛋白的能力(Grassmann and Definer 1953)。在Kirty最初的论文中，是用酚—水两相混合液在室温下提取哺乳动物匀浆，结果RNA分配到了水相，而DNA结合在蛋白上留在两相界面上。Kirty很快意识到用阴离子盐的溶液代替水就能将RNA和DNA同时释放到水相(Kirty 1957，综述见Kirty 1964)。
鸡眼镜图A8-2 吸出上清液
手持打开盖子的微型离心管成一定角度，使沉淀物在上侧，将一个一次性吸头连至真空管道，从管内抽吸液体。把吸头置于离心管下侧，恰好在液体的凹面以下。随着液体的吸出，可将吸头移向管底。抽吸要温和，以免沉淀吸入吸头，并应使吸头的尖部
离开沉淀。最后吸尽附着于管壁的液滴。微机消谐装置umg92
(5)用自动微量移液器或连于真空管道的一次性吸头(见图A8-2)小心移出上清液，注意不要扰动沉淀(有时沉淀是看不见的)。用吸头吸尽附于管壁的所有液滴。在沉淀比较珍贵的DNA样品时，最好暂时留存上清液，直至确定已回收到沉淀的DNA后再废弃。
(6)加半管70%乙醇，于4℃以最高转速离心2min。
(7)重复第5步。
网络巡检(8)将离心管于室温下敞口放置在实验台上，直至残留的液体挥干。过去常用冻干机干燥沉淀，这一步不仅没有必要，而且也不适当，因为这样会引起小片段DNA(小于 400个核苷酸)的变性(Svaren et al，1987)，还大大降低大片段DNA的收率。
(9)将DNA沉淀(沉淀常常是看不见的)重新溶解于适当体积的缓冲液(一般为pH 7.6-8.0的
TE)，用缓冲液充分漂洗管壁。
[注]i在微型离心管中离心之后，并非所有DNA沉淀都沉积在管底，沉积在管壁的DNA最多可达50%。为了回收到所有DNA，应使液滴在管壁的适当部位来回滚动，可用微量加液器上的一次性
吸头推动液滴。
ii可用1倍体积的异丙醇代替2倍体积的乙醇沉淀DNA。异丙醇沉淀的优点是离心液体的体积较小，但异丙醇挥发性较乙醇差而难于去除，另外有些溶质如蔗糖和氯化钠等在用异丙醇时更容易共沉淀。总之，除非必须降低液体的体积，一般最好用乙醇沉淀。
iii一般用乙醇从溶液中沉淀出来的DNA重溶于低离子强度的缓冲液如TE(pH8.0)中比较容易，偶尔在用含MgCl2或浓度高于0.1mol/L Nacl的缓冲液直接溶解DNA沉淀时可能要遇到一点困难。因此最好是先用少量低离子强度的缓冲液将DNA溶解后再调节缓冲液的成分。若样品不易溶于较小体积的缓冲液，可用多一些缓冲液溶解，再重新用乙醇沉淀。第二次沉淀有助于去除多余的盐及可
能妨碍DNA溶解的其他成分。
用乙醇沉淀RNA
RNA可以用含2.5-3.0倍体积的乙醇从含有0.8mol/L LiCl、5mol/L醋酸铵或0.3mol/L醋酸钠的溶液中有效地沉淀下来。选择上述哪一种盐要取决于其后RNA的用途。由于十二烷基硫酸钾盐的极难溶，若要将沉淀得到的RNA溶于含SDS的缓冲液(如用寡聚dT-纤维素层析时就使用这种缓冲液)则应避免使用醋酸钾。同样，如果RNA已溶于含有SDS的缓冲液中，沉淀时也不要用醋酸钾。
[注]用于沉淀RNA的溶液应是无RNA酶的(见第7章)。
渣油加氢用氯化锂沉淀大分子RNA
小分子RNA(如tRNA和5SrRNA)在离子强度高的溶液中可溶，而大分子RNA(如rRNA和mRNA)
则不溶，可通过离心沉淀下来。
(1)测量样品的体积，加0.2倍体积无RNA酶的8mol/L LiCl，充分混匀，置冰浴中至少2h。
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