（PCR-荧光探针法）说明书
【产品名称】
通用名称：丙型肝炎病毒核酸测定试剂盒（PCR–荧光探针法）
【包装规格】 48人份/盒
【预期用途】
本试剂盒用于体外定量测定血清样本中的丙型肝炎病毒（HCV）核酸（RNA），适用于需要进行HCV感染检测的患者和接受抗病毒的丙型肝炎患者。 本试剂盒可以检测HCV 1~6型临床常见型别，主要通过对丙型肝炎患者血液中HCV RNA含量及变化情况的监测，用于评估抗病毒的应答和效果。该检测不得作为患者病情评价的唯一指标，必须结合临床表现和其他实验室检测指标对患者病情进行综合评价。本试剂盒不得用于HCV的血源筛查。
【检验原理】
本试剂盒在PCR扩增管内用含磁珠的裂解液提取血清样本中HCV RNA，并在同一管中进行扩增，HCV RNA在逆转录酶作用下反转录成HCV cDNA，然后在DNA聚合酶的作用下，应用TaqMan探针技术扩增HCV cDNA并进行实时荧光定量检测。 本试剂盒校准品和质控品为含有丙型肝炎病毒的临床血清样本（已灭活）。
本试剂盒通过检测内标来监测样本中是否有PCR抑制物，避免假阴性。
【主要组成成分】
丙型肝炎病毒核酸测定试剂盒（PCR–荧光探针法）
序号产品组成主要成分规格与装量
RLB 核酸提取
试剂HCV裂解液（含磁珠）氢氧化钠、氯化钾、Tris碱、构象磁珠7.5ml×1瓶
RWB HCV漂洗化钾、乙酸钠25.0ml×1瓶
1 PCR扩增
试剂HCV RT-PCR 反应液引物、探针、脱氧核糖核苷三磷酸、镁离子0.95ml×2管
2 HCV酶混合液M-MLV逆转录酶、DNA聚合酶100μl×1管
3
校准品HCV校准品①（1.0～3.0）×106IU/ml 定值HCV阳性血清样本（已灭活）0.35 ml×1管
4 HCV校准品②（1.0～3.0）×105IU/ml 定值HCV阳性血清样本（已灭活）0.3
5 ml×1管
5 HCV校准品③（1.0～3.0）×104IU/ml 定值HCV阳性血清样本（已灭活）0.35 ml×1管
6 HCV校准品④（1.0～3.0）×103IU/ml 定值HCV阳性血清样本（已灭活）0.35 ml×1管
7
质控品HCV强阳性质控品（0.5～5.0）×104IU/ml HCV阳性混合血清样本（已灭活）0.35 ml×1管
8 HCV弱阳性质控品（100～700）IU/ml HCV阳性混合血清样本（已灭活）0.35 ml×1管
9 HCV 阴性质控品HCV阴性混合血清样本（已灭活）0.35 ml×1管
10 内标HCV内标内标核酸模板60μl×1管
备注：a.校准品①～④的参数和强阳、弱阳性质控品的定值存在批间差异（均在以上范围内）。
详见试剂盒内的说明书附页。
b.不同批号试剂盒中的组分请勿混用！
c.自备试验物品：0.2ml PCR反应管、离心机、各种规格的移液器及吸头、磁力架，配套使用本公司推
荐的磁力架。
【储存条件及有效期】
1.核酸提取试剂盒，在2～8℃条件下保存。
2.PCR扩增试剂盒，在-20℃±5℃避光保存，避免反复冻融（不超过3次）。
3.有效期：本试剂盒有效期12个月，请在有效期内使用。生产日期及有效期详见标签。
4.模拟运输实验表明，运输条件不会影响产品的稳定性和有效期，但运输时间不应超过7天。
【适用仪器】
适用于SLAN-96P、MX3000P/3005P和ABI7500实时荧光PCR仪。
【样本要求】
1. 适用样本类型：血清。
2. 样本采集：本试剂盒适用于血清样本。采集血清样本时，用无菌注射器采受检者2～5ml静脉血，收集于
无菌干燥管（最好带分离胶），先室温放置30分钟，然后1500g水平离心3～5分钟，使血清和细胞分离，可将上清（注意勿吸入红细胞）转入无DNA酶和RNA酶的无菌离心管中备用。
3. 存放：待测样本在2～8℃保存不应超过两周；-20℃以下长期保存，应避免反复冻融，检测前恢复至室
温。
4. 运输：标本运输应采用冰壶加冰或泡沫箱加冰，在冷冻和密封状态下运输。
【检验方法】
（一）试剂准备（试剂准备区）
1.取出各种试剂组分，室温避光放置，待其温度平衡至室温后，备用。
2.提取液的配制：含磁珠的HCV裂解液(RLB)在使用前充分混匀，按（HCV裂解液150μl/人份+HCV内标1.0μl
/人份）的比例配制，充分混匀立即按150μl/孔分装到PCR扩增管中，提取液确保在PCR扩增管底部（如有粘壁提取液和磁珠，可在操作台上轻轻振荡使其落到管底）。
3.PCR扩增试剂配制：根据待测样本、HCV阴性质控品、HCV弱阳性质控品、HCV强阳性质控品及HCV校准品
①～④的数量，取相应量的HCV RT-PCR反应液及HCV酶混合液，按（HCV RT-PCR反应液38.0μl/人份+HCV
酶混合液2.0μl /人份）比例配制，充分混匀成PCR-Mix，即刻使用。
（二）核酸提取纯化（标本处理区）
1.在已经分装提取液的PCR管内加入100μl待测样本或HCV阴性质控品、HCV弱阳性质控品、HCV强阳性质
控品、HCV校准品①～④；轻轻吹打混匀2～3次；室温静置5分钟。
2.将PCR管转移至磁力架（使用本公司推荐的磁力架）上，静置3分钟，用移液器或负压装置吸弃上清液，
注意勿吸走磁珠。
3.保持PCR管在磁力架上，每孔加入HCV漂洗液(RWB) 250μl，静置1分钟，用移液器或负压装置吸弃上清
液，注意勿留残液。
4.用RWB重复步骤3再洗涤一次，注意PCR管底勿留残液。
（三）扩增试剂加入（标本处理区）
将配制好的PCR-Mix每孔40μl悬空加入到含有核酸磁珠的PCR管中，盖好扩增管盖，颠倒轻轻弹下磁珠，使PCR-Mix与磁珠充分混匀，水平瞬时离心。将PCR反应管转移至检测区，置于荧光定量PCR仪上进行检测。
（四）PCR扩增（检测区）
1. 将PCR反应管放入扩增仪，按对应顺序设置HCV阴性质控品、HCV弱阳性质控品、HCV强阳性质控品、
HCV校准品①～④及待测样本，并设置样本名称及校准品浓度。
2. 荧光PCR 扩增程序，以SLAN-96P为例设置如下(MX3000P/3005P和ABI7500程序相同)：
步骤温度时间循环数1
逆转录45℃15分钟
1立式导热油加热器
预变性95℃5分钟
2
变性94℃15秒亨润成型机炮筒公司
50
退火，延伸，荧光采集58℃45秒(采集荧光)
检测通道选择：目的基因（FAM）、内标（VIC或HEX）
设置完毕，保存文件，运行反应程序。
1. 扩增曲线特征的描述：扩增曲线一般呈S型。
2. 基线设定：根据实验情况，应该选择荧光本底值较稳定的一段区域作为基线的设定范围。
3. 阈值设定：超过阴性质控品扩增曲线的最高点即可。
4. 结果分析：设定好基线和阈值线后，即可进行结果分析。
选择FAM通道，可以得到待测样本、质控品的检测结果；选择HEX或者VIC通道，可以得到内标的检测结果。
（注：具体设置方法请参考不同仪器的使用说明书。）
（六）参考值
通过参考值的研究试验确定本试剂盒的检测下限为15IU/ml，定量限为50IU/ml，靶Ct值≤40，内标Ct≤
40。
（七）实验的有效性判断
1.校准品须全部为阳性，且线性相关系数|r|≥0.980。
2.阴性质控品的测定结果应为未检出且内标Ct值≤40。
3.强阳性质控品Ct值＜32，定量结果范围为（0.5～5.0）×104IU/ml；弱阳性质控品Ct值＜37，定量结果范围为（100～700）IU/ml。
以上要求必须在同次实验中满足，否则检测结果视为无效，须重新检测。
【检验结果的解释】
1 若样本检测结果为50～1.0×108IU/ml，且扩增曲线呈现S型，同时样本Ct值≤40，且内标Ct值≤40，判断结果有效，可直接报告阳性及相应浓度值。
2 若样本检测结果HCV RNA＞1.0×108IU/ml，且扩增曲线呈现S型，同时样本Ct值≤40，且内标Ct值≤40，即可直接报告为HCV RNA＞1.0×108IU/ml，若需要精确定量可根据结果，将样本稀释至1.0×108IU/ml以下再复测。
3若样本检测结果为15IU/ml≤HCV RNA＜50IU/ml，同时样本Ct值≤40时，且内标Ct值≤40，则表明病毒载量低，可直接报告结果，但应注明：检测浓度仅供参考。
差速防坠器4若样本检测结果为HCV RNA＜15IU/ml，样本Ct值≤40，且内标Ct值≤40，则报告结果为HCV RNA浓度低于试剂盒检测下限；若内标不正常（Ct＞40或无数值），则该样本的检测结果无效，应查并排除原因，并对此样本进行重复实验（若重复实验的检测结果仍无效，请与本公司联系）。
【检测方法的局限性】
1. 本试剂盒的检测结果仅供临床参考，对患者的临床诊治应结合其症状/体征、病史、其他实验室检查及反应等情况综合考虑。
2. 不合理的样本采集、转运、储存及处理过程均有可能导致错误的检测结果。
3.本试剂盒适用于血清样本的检测，其他类型样本需进行验证后方可使用，检测结果仅供参考，不能作为临床报告。本试剂盒适用于SLAN-96P、MX3000P/3005P和ABI7500系列PCR扩增仪器，其他机型需进行对比验证后方可使用。
4. 本试剂盒检测的靶序列为丙型肝炎病毒基因，该靶序列在各毒株间都有高度保守且很稳定。但如果在靶序列处发生基因突变，则有可能造成假阴性结果，即发生漏检。
5.HCV RNA的定量取决于样本中存在的病毒颗粒数，而这会受到样本收集方法，病人因素（如年龄，是否存在症状）和/或感染阶段等因素的影响。
【产品性能指标】
1.本试剂盒检测国家标准物质，阴、阳性参考品符合率为100%。
2.定量限及最低检出限：分别对1、2、3、4型等样本进行检测，采用HCV阴性血清稀释至最低检测限浓度，
本试剂盒的定量限为50IU/ml，最低检测限15IU/ml。
3.精密度：采用企业内部精密度参考品进行精密度评价，其浓度对数值的变异系数（CV，%）≤5%。
4.线性范围：采用HCV RNA定量高于1.0×108IU/ml临床样本，采用HCV阴性血清进行比例稀释，制备50～
1.0×108IU/ml的线性样本进行检测。线性范围在50～1.0×108IU/ml线性相关系数|r|≥0.980
5.对不同基因型的覆盖：本试剂盒可以检测丙型肝炎病毒1~6型。
6.分析特异性：
①.交叉反应：对于可能存在的检测干扰的病原体如乙型肝炎病毒（HBV）、人类免疫缺陷病毒（HIV）、EB
病毒、人巨细胞病毒（HCMV），本试剂盒检测结果均为阴性。
②.干扰物质：临床样本中常见干扰物质高浓度的胆红素（340μmol/L）、甘油三酯（5mmol/L）、血红蛋白（6g/L）。
③.药物影响: 抗病毒药物干扰素（IFN）对本试剂盒检测无明显干扰。
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7.对比试验研究：本试剂盒临床检测结果表明，在50～1.0×108IU/ml范围内，本品与罗氏COBAS试剂对比，
结果经SPSS差异显著性分析，结果二者无显著性差异。
【注意事项】
1. 本试剂盒仅用于体外检测，使用前请仔细阅读本说明书。由于本试验涉及到病毒RNA的提取及PCR扩增，应小心避免试剂和扩增反应混合物受到污染。使用器皿要用DEPC水处理防止RNA酶污染导致对实验结果的影响；实验过程应设置空白对照和阴性质控品实时监控PCR扩增污染的情况。
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2.试验前请熟悉和掌握需使用仪器的操作方法和注意事项，对每次实验进行质量控制。
3.负压泵吸的吸力请调节在7~40L/min流量范围内使用；本公司售卖的磁力架效期为2年，注意更换。
4.所有检测样品及校准品和质控品应视为具有传染性物质，实验过程中穿工作服，戴一次性手套并经常更换以及避免样品间的交叉污染；样本操作和废弃物处理均需符合相关法规要求，如：卫生部《微生物生物医学实验室生物安全通用准则》和《医疗废物管理条例》。
5.裂解液具有一定的腐蚀性，避免接触皮肤，黏膜等，如不慎触及请立即用大量清水冲洗处理。
6. 实验室管理应严格按照PCR基因扩增实验室的管理规范，实验人员必须进行专业培训。
【参考文献】
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【生产企业】
注册人/生产企业名称：北京纳捷诊断试剂有限公司
住所：北京市北京经济技术开发区科创六街88号院8号楼4单元201室
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售后服务单位名称：
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生产地址：北京市北京经济技术开发区科创六街88号院8号楼4单元201室
电力线网络摄像机生产许可证编号：
【医疗器械注册证编号/产品技术要求编号】
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