B链球菌核酸检测试剂注册技术审查指导原则（2021年第24号）
零时刻2021年4⽉15⽇，国家药监局发布《B链球菌核酸检测试剂注册技术审查指导原则（2021年第24号）》。
B链球菌核酸检测试剂注册技术
审查指导原则
本指导原则旨在指导注册申请⼈对B链球菌核酸检测试剂注册申报资料的准备及撰写，同时也为技术审评部门对注册申报资料的技术审评提供参考。 本指导原则是针对B链球菌核酸检测试剂的⼀般要求，申请⼈应依据产品的具体特性确定其中内容是否适⽤，若不适⽤，需具体阐述理由及相应的科学依据，并依据产品的具体特性对注册申报资料的内容进⾏充实和细化。
本指导原则是对申请⼈和审查⼈员的指导性⽂件，但不包括注册审批所涉及的⾏政事项，亦不作为法规强制执⾏，如果有能够满⾜相关法规要求的其他⽅法，也可以采⽤，但需要详细阐明理由，并对其科学合理性进⾏验证，提供详细的研究资料和验证资料，相关⼈员应在遵循相关法规的前提下使⽤本指导原则。 本指导原则是在现⾏法规和标准体系以及当前认知⽔平下制定的，随着法规和标准的不断完善，以及科学技术的不断发展，本指导原则相关内容也将适时进⾏调整。
⼀、适⽤范围
⽆乳链球菌（Streptococcus agalactiae）在兰⽒抗原分类中属于B，B⽬前只发现这⼀种细菌，所以⼀般也称为B链球菌（Group B Streptococcus，GBS）。GBS为⼀种β溶⾎的⾰兰阳性球菌，成对或呈短链状排列，根据细菌的荚膜多糖不同，GBS可分为Ia、Ib、Ic、II、III、IV、V、VI、VII、VIII和IX等。GBS是围产期和新⽣⼉感染疾病的致病菌，引起孕产妇的绒⽑膜⽺膜炎，导致流产、胎膜早破及宫内感染，也可导致新⽣⼉发⽣肺炎、脑膜炎、败⾎症等。2018年孕前和孕期保健指南中提到对⾼危因素的孕妇妊娠35～37周进⾏GBS筛查。
本指导原则所述GBS核酸检测试剂指基于分⼦⽣物学相关⽅法的核酸检测技术，以GBS核酸序列为检测靶标，对来⾃⼈体样本（如孕妇阴道拭⼦、直肠拭⼦、阴道和直肠联合拭⼦）或经增菌培养后⼈体样本中的GBS进⾏体外定性检测的试剂。结合临床表现和其他实验室指标，⽤于GBS感染实验室诊断及临床应⽤。 本指导原则适⽤于基于实时荧光PCR（Real-time polymerase chain reaction）检测⽅法的GBS核酸检测试剂。对于其他⽅法，可能部分要求不完全适⽤或本⽂所述内容不够全⾯，申请⼈可以根据产品特
性对适⽤部分进⾏评价或补充其他的评价资料进⾏相应性能的验证，但需阐述不适⽤的理由，并说明替代⽅法的科学合理性。
⼆、注册申报资料要求
（⼀）综述资料
综述资料主要包括产品预期⽤途、产品描述、有关⽣物安全性的说明、研究结果的总结评价以及同类产品上市情况介绍等内容。其中同类产品上市情况介绍部分应着重从⽅法学、不同临床型别检出能⼒、样本类型、样本采集与制备⽅式等⽅⾯写明拟申报产品与⽬前市场上已获批准的同类产品之间的主要区别。
（⼆）主要原材料的研究资料
提供主要原材料如引物、探针、酶、阴性对照、阳性对照、内对照（内标）以及企业参考品等的选择与来源、制备过程、质量分析和质量控制标准等的研究资料。详细说明基因位点选择的依据，并提供能够覆盖临床型别的证据。若主要原材料为企业⾃⼰⽣产，其⽣产⼯艺必须相对稳定，并提供其详细制备过程；如主要原材料购⾃其他供货商，应提供的资料包括：供货商提供的质量标准、出⼚检定报告或性能指标证书，以及该原材料到货后的质量检验资料。
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身份证保护申报试剂的质控体系通过设置阳性、阴性、内对照（内标）等各种对照来实现，需考虑对样本核酸提取/纯化、配液及加样、试剂及仪器性能、扩增反应抑制物（管内抑制）、交叉污染、靶核酸降解等因素可能造成的假阴性或假阳性结果的质量控制。企业应对各种对照的Ct值或相应判断数值做出明确的范围要求。
1.内对照（内标）
1.内对照（内标）
内对照可对实验过程可能存在的扩增反应抑制物、仪器、试剂和操作等所导致的假阴性结果进⾏质量控制。申请⼈应对内对照的引物、探针和模板浓度做精确的验证，既要保证内标荧光通道呈明显的阳性曲线⼜要尽量降低对靶核酸序列检测造成的抑制⽽导致假阴性。
2.阳性对照
阳性对照可对实验过程进⾏质控。阳性对照建议采⽤含有靶核酸序列的GBS菌株或者⼈⼯构建的质粒等，企业应对阳性对照的Ct值做出明确的范围要求。
3.阴性对照
阴性对照对可能存在的交叉污染产⽣的假阳性结果或扩增反应中背景值进⾏质量控制。阴性对照应参与样本处理和检测的全过程。建议采⽤与实际检测样本具有相同或相似性状的基质溶液作为阴性对照，不推荐采⽤⽔作为阴性对照。
4.PCR组分的主要材料（包括脱氧三磷酸核苷、引物和探针、各种酶等主要原料）的选择、制备、质量控制标准及实验研究资料，主要包括以下内容：
4.1脱氧三磷酸核苷（dNTP）
核酸的组成成分，包括：dATP、dUTP、dGTP、dCTP和dTTP，对纯度、浓度、保存稳定性等详细验证资料。
4.2引物和探针：
应详述引物和探针的设计原则，提供引物、探针核酸序列、模板核酸序列及两者的对应情况。建议设计两套或多套引物、探针以供筛选，针对所有预期适⽤型别进⾏检出能⼒和特异性（如交叉反应）的评价，选择最佳组合，并提交筛选的研究数据。
如为外购，引物和探针应提供合成机构出具的质检证明，如纯度（应达到电泳级或HPLC级）、序列准确性等，申请⼈应对引物和探针核酸序列准确性、纯度、浓度、探针标记的荧光素或化学发光物等
进⾏核实，同时申请⼈应进⾏功能性验证，并提供相关资料。
4.3 PCR反应所需酶
DNA聚合酶，应具有DNA聚合酶活性，⽆核酸内切酶活性，具热稳定性，如：94℃保温1⼩时后仍保持50%活性；尿嘧啶糖基化酶（UNG），具有尿嘧啶糖基化活性，⽆核酸外切酶及核酸内切酶活性，应对酶活性有合理验证；应提供有关保存稳定性、活性及功能性实验等验证资料。
5.企业参考品
申请⼈应提供企业参考品的详细制备过程，包括组成、来源、菌株特性（如名称、型别、靶核酸的拷贝数/细菌浓度等）信息。企业参考品的项⽬应包括：阴性参考品、阳性参考品、最低检测限参考品、精密度参考品等。阳性参考品、最低检出限参考品应能覆盖临床常见型别，⾄少包括Ia、Ib、III、V等。阳性参考品、最低检测限参考品、精密度参考品等建议采⽤灭活的菌株。阴性参考品应⾄少包含分析性能研究资料中交叉反应必须验证的微⽣物。
（三）主要⽣产⼯艺及反应体系的研究资料
1.介绍产品主要⽣产⼯艺，可以图表⽅式表⽰，并说明主要⽣产⼯艺的确定依据。
2.反应原理介绍。
3.详述样本采集、样本处理⽅式的选择（如对样本采集拭⼦和保存液的验证，样本类型为增菌后的⼈体样本，需验证配套的增菌培养基），提供相关的研究资料。
4.核酸提取/纯化⽅法确定的研究资料。
4.核酸提取/纯化⽅法确定的研究资料。
5.确定最佳PCR反应体系的研究资料，包括酶浓度、引物/探针浓度、dNTP浓度、阳离⼦浓度、样本量及反应体积等以及PCR各阶段温度、时间及循环数的研究资料。
6.不同适⽤机型的反应条件的对⽐分析，如果有差异应分别详述。
（四）分析性能研究资料
申请⼈应提交⽣产者在产品研制或成品验证阶段对试剂盒进⾏的所有性能验证的研究资料，对于每项分析性能的评价都应包括具体研究⽬的、实验设计、研究⽅法、可接受标准、实验数据、统计⽅法等详细资料。有关分析性能验证的背景信息也应在申报资料中有所体现，包括实验地点（实验室）、适⽤仪器、试剂规格、批号、临床样本来源等。分析性能评价的实验⽅法可以参考相关的美国临床实验室标准化协会批准指南（CLSI-EP）⽂件或国内有关体外诊断产品性能评估的指导原则进⾏，建议着重对以下分析性能进⾏研究。
1.GBS DNA提取
细菌DNA提取主要有以下⽬的：富集⽬的基因浓度、保证⽬的基因序列的完整性、增加PCR模板溶液均⼀性、去除PCR抑制物，是决定PCR成败的关键环节。因此，⽆论申报产品是否含有DNA分离/纯化的组分，企业都应对核酸提取的环节做详细的验证。临床标本中可能含有各式各样的PCR抑制物，因此，对于DNA提取试剂的选择，除最⼤量分离出⽬的DNA外，还应有纯化步骤，尽可能去除PCR抑制物。⽬前常见的DNA分离纯化⽅法和改良⽅法各有优势和不⾜，申请⼈应结合申报产品的特性，合理选择DNA分离/纯化试剂，并提供详细的验证资料。
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2.最低检出限
2.1最低检测限的确定
建议使⽤GBS菌株的梯度稀释液来确定最低检测限。每个梯度进⾏不少于20次的重复检测，将具有95%阳性检出率的最低菌株浓度作为最低检测限。应明确每份菌株的来源、浓度、制备⽅法等信息。收获时间到
2.2最低检测限的验证
建议使⽤最低检测限⽔平的菌株浓度，对不同来源的GBS菌株或真实临床样本进⾏⾄少20次的重复验证，阳性检出率不低于95%。注册申请⼈应能够提供⽤于最低检测限验证的各个菌株或临床样本的来
源、制备⽅法及浓度等信息。最低检测限建议采⽤菌落形成单位（CFU）和靶核酸的拷贝数两种⽅法分别进⾏研究。
最低检测限的确定和验证需要覆盖临床常见型别，⾄少包括Ia、Ib、III、V等。
3.反应性（包容性）
建议使⽤具有时间和区域特征性的不同来源的临床样本进⾏验证，⾄少包括GBS临床常见型别，如Ia、Ib、III、V等。建议在略⾼于最低检测限浓度进⾏研究，并提供样本的来源、浓度、菌株型别的确认⽅法等信息。
4.精密度
注册申请⼈应对精密度指标，如标准差或变异系数等评价标准做出合理要求。精密度研究需要覆盖临床常见临床型别，⾄少包括Ia、Ib、III、V等。精密度评价试验应包含核酸分离/纯化步骤。针对本类产品的精密度评价主要包括以下要求。
4.1对可能影响检测精密度的主要变量进⾏验证，除检测试剂（包括核酸分离/纯化组分）本⾝的影响外，还应对分析仪、操作者、地点、检测轮次等要素进⾏相关的验证。
4.2设定合理的精密度评价周期，例如：为期⾄少20天的检测，具体⽅案可参考EP⽂件进⾏。从⽽对批内/批间、⽇内/⽇间以及不同操作者之间的精密度进⾏综合评价。
4.3⽤于精密度评价的菌株或临床样本均应⾄少包含3个⽔平：阴性样品、临界阳性样品、（中或强）阳性样品，并根据产品特性设定适当的精密度要求，临床样本精密度评价中的每⼀次检测均应从核酸提取开始。
产品特性设定适当的精密度要求，临床样本精密度评价中的每⼀次检测均应从核酸提取开始。
液压滑环
4.3.1阴性样本：待测物浓度低于最低检测限或为零浓度，阴性检出率为100%（n≥20）；
4.3.2临界阳性样本：待测物浓度略⾼于试剂盒的最低检测限，阳性检出率为100%（n≥20）；
4.3.3中/强阳性样本：待测物浓度呈中度到强阳性，阳性检出率为100%且CV≤5%（n≥20）。
5.特异性
5.1交叉反应
5.1.1⽤于GBS检测试剂交叉反应验证的病原体种类主要考虑以下⼏⽅⾯：近缘菌、易引起相同或相似的临床症状微⽣物、感染部位的定植菌等（推荐种类见表1）。
5.1.2建议在病毒和细菌感染的医学相关⽔平进⾏交叉反应的验证。通常，细菌感染的⽔平为106 CFU/mL或更⾼，病毒为105 PFU/mL或更⾼。
5.1.3申请⼈应提供所有⽤于交叉反应验证的病毒和细菌的来源、种属/型别和浓度确认等试验资料。有关交叉反应验证的信息应以列表的⽅式在产品说明书的【产品性能指标】项中有所体现。
表1 ⽤于交叉反应研究的微⽣物（推荐）
（其中标记*的项⽬为选择性验证）
微⽣物
A链球菌
C链球菌
G链球菌
肺炎链球菌
草绿⾊链球菌
粪肠球菌
屎肠球菌
淋病奈瑟菌
嗜酸乳杆菌
梅毒螺旋体
沙眼⾐原体
⼈型⽀原体
阴道⽑滴⾍
⽩⾊念珠菌
单纯疱疹病毒Ⅱ型
表⽪葡萄球菌*
假⾗链球菌*
阴道棒状杆菌*
脆弱类杆菌*
耻垢分枝杆菌*
⼈乳头瘤病毒*
5.2⼲扰物质
建议注册申请⼈根据所采集的样本类型，针对可能存在的⼲扰情况进⾏验证。建议在每种⼲扰物质的潜在最⼤浓度（“最差条件”）进⾏评价，并在GBS临界阳性⽔平进⾏检测。潜在⼲扰物质的选取应⾄少包括：⾎红蛋⽩、⽩细胞、宫颈粘液、⼥性卫⽣⽤品、阴道⽤抗真菌药物等。
6.提供企业参考品验证资料：根据主要原材料研究资料中的企业参考品设置情况，采⽤三批产品对企业参考品进⾏检验并提供详细的实验数据（如适⽤）。
7.其他需注意问题
对于适⽤多个机型的产品，应提供如产品说明书【适⽤仪器】项中所列的所有型号仪器的性能评估资料。如适⽤于不同样本类型，应针对不同样本类型分别验证。
（五）阳性判断值研究资料
阳性判断值确定资料主要指对申报产品核酸检测的Ct值，即结果判断的临界值进⾏确认的资料。阳性判断值研究资料样本来源应考虑不同年龄、地域等因素，尽可能考虑样本来源的多样性、代表性。如存在判定值灰区，应提供灰区的确认资料。建议申请⼈采⽤受试者⼯作特征（ROC）曲线的⽅式确定申报试剂⽤于结果判断的临界值。有关ROC曲线分析的细节，请参考国内外相关的⽂件。如采⽤其他⽅法对阳性判断值进⾏确认研究，应说明其合理性。提供内标值的确定⽅法和研究资料。阈值设置应科学合理。
另外，考虑建⽴阳性判断值时使⽤的临床样本对于⽬标⼈的代表性，建议通过临床评价进⼀步验证和确认阳性判断值的准确性。
（六）稳定性研究资料
稳定性研究资料主要涉及两部分内容，申报试剂的稳定性和适⽤样本的稳定性研究。前者主要包括实时稳定性（有效期）、运输稳定性、开瓶稳定性及冻融次数限制等研究，申请⼈可根据实际需要选择
合理的稳定性研究⽅案。稳定性研究资料应包括研究⽅法的确定依据、具体的实施⽅案、详细的研究数据以及结论。对于实时稳定性研究，应提供⾄少三批样品在实际储存条件下保存⾄成品有效期后的研究资料。
应对样本稳定性进⾏研究，主要包括室温保存、冷藏和冷冻条件下的有效期验证，可以在合理的温度范围内选择温度点（温度范围），每间隔⼀定的时间段即对储存样本进⾏分析验证，从⽽确认不同类型样本的稳定性。适于冷冻保存的样本还应对冻融次数进⾏评价。
试剂稳定性和样本稳定性两部分内容的研究结果均应在说明书【储存条件及有效期】和【样本要求】两项中进⾏详细说明。
（七）临床评价资料
临床试验的开展、⽅案的制定以及报告的撰写等均应符合相关法规及《体外诊断试剂临床试验技术指导原则》（原国家
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