国家标准《磁珠法DNA提取试剂盒检测通则》编制说明 （⼀）⼯作简况，包括任务来源、协作单位、主要⼯作过程、国家标准主要起草⼈及其所做的⼯作等；
1、任务来源
本标准根据国标委公布的2018 年第四批国家标准计划项⽬（国标委综合83 号），本项⽬计划编号为20184465-T-469 ，名称为磁珠法DNA提取试剂盒检测通则。
本标准由全国⽣化检测标准化技术委员会（SAC/TC 387）提出并归⼝。
本标准由联合起草。
2、⽬的和意义
为适应⾼灵敏度、⾃动化操作的发展需求，磁珠法核酸提取由此诞⽣。磁珠为拥有超顺磁性，表⾯经过了功能化修饰，在磁场中能够迅速聚集，离开磁场后⼜能够快速分散，能实现磁分离的均匀分散的⼀种磁性纳⽶级或者微⽶级球状或⽆定形颗粒物，其表⾯修饰有丰富的活性基团，可以和核酸分⼦在⼀定的
缓冲条件下进⾏可逆地结合。与传统的分离⽅法相⽐，磁珠⽤于⽣化样品复杂组分的分离，能够实现分离和富集的同时，有效地提⾼了分离速度和富集效率，同时也使分析检测的灵敏度⼤⼤提升。磁珠与核酸的特异性结合使得提取的核酸纯度⾼，浓度⼤，样本需求量低，不需要苯酚和氯仿等毒性⼤的有机溶剂，提取步骤简单，不需离⼼，不仅可以满⾜⼤量规模提取的要求，还能实现⾃动化操作，具有传统核酸提取⽆法⽐拟的优势，是⽬前核酸制备的⼀个重要⽅向。
磁珠法核酸提取是⼀项将⽣物分⼦技术与纳⽶材料科学相结合的新型技术，是DNA提取纯化领域的⼀项重⼤突破，能从⾎液，动、植物组织，⾷品，⼟壤，粪便，唾液等样本中分离纯化DNA，已⼴泛应⽤于⾷品，法医，医疗等领域。现国内磁珠法核酸提取产品⼚家层出不穷，如海狸医学、英芮诚、惠尔纳⽶、新百基等，产品五花⼋门，质量参差不齐，市场较混乱。且随着⼆代测序的兴起对⾃动化的需求越来越⾼，磁珠法核酸提取领域并没有相应的标准，加上，如动植物核酸提取、回收和⼩量⾎液基因组提取试剂盒的要求也都差异很⼤。为规范磁珠法核酸提取试剂盒的质量，迫切需要建⽴其质量表征指标，规范其技术要求和测试⽅法。
3、协作单位
4、标准编制过程和主要⼯作过程
4.1 项⽬预研
（1）2017 年 2 ⽉⾄2018年 3 ⽉，标准起草单位组织相关技术⼈员对标准项⽬进⾏了预研，课题组成员⼴泛收集了国内外相关标准、⽂献，了解了国内外相关技术动态，并且明确了⼯作思路和进程安排。
（2）2018 年 4 ⽉标准起草单位在收到全国⽣化检测标准化技术委员会 2 号⽂件后，提交了项⽬建议书以及国家标准草案。
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（3）2018 年9 ⽉，起草⼩组对全国⽣化检测标准化技术委员会汇报了《磁珠法DNA 提取纯化试剂盒检测通则》标准的起草⼯作，与会专家就《磁珠法DNA提取纯化试剂盒检测通则》标准（草案）进⾏了讨论，提出了宝贵的意见和建议。主要意见包括适⽤对象、检测浓度范围对应的检测⽅法等。标准起草⼩组根据专家意见进⾏了修改和完善。
小型锅炉4.2 项⽬⽴项
（3）2018 年12 ⽉收到全国⽣化检测标准化技术委员会⽣检标〔2019〕1号⽂件以及该标委会转发的国标委综合83 号《国家标准委关于下达2018年第四批国家标准制修订计划的通知》⽴项⽂件，计划编号：20184465-T-469。
（4）2018 年9 ⽉⾄2019 年 6 ⽉，进⾏《磁珠法DNA提取纯化试剂盒检测通则》标准的起草研制⼯
作。完成了《磁珠法DNA 提取纯化试剂盒检测通则》标准的编制说明，并对全国⽣化检测标准化技术委员会汇报了《磁珠法DNA提取纯化试剂盒检测通则》标准（草案）进⼀步完善和修改情况，向全国⽣化检测标准化技术委员会提交了该标准（征求意见稿）和编制说明。
（5）2019 年7 ⽉ 4 ⽇，全国⽣化检测标准化技术委员会就《磁珠法DNA提取纯化试剂盒检测通则》标准向全体委员专家（44位专家）征求意见。共收集44位委员专家回函，其中收到9份有意见或建议的单位回函。起草⼩组已按照专家意见建议进⾏修改完善。详见“国家标准反馈意见汇总表—《磁珠法DNA提取纯化试剂盒检测通则》标准征求意见稿。”流水线称重
(6) 2019 年7 ⽉8 ⽇，在中国测试技术研究院综合楼四楼⼤会议室召开了“《磁珠法DNA提取纯化试剂盒检测通则》等五项国家标准项⽬讨论会”，就《磁珠法DNA提取纯化试剂盒检测通则》标准（征求意见稿）向涉及检测鉴定及使⽤该产品的相关⾏业相关专家征求意见。其中与会专家提出了宝贵意见建议，起草单位已按照与会专家的意见建议进⾏修改完善。详见“国家标准反馈意见汇总表—《磁珠法DNA提取纯化试剂盒检测通则》标准征求意见稿。”
(7) 2020年4⽉⾄6⽉，全国⽣化检测标准化技术委员会就《磁珠法DNA提取纯化试剂盒检测通则》标准（征求意见稿）在标准
制修订系统中征求意见。其中提出了宝贵意见建议，起草单位已按照的意见建议进⾏修改完善。详见“
国家标准反馈意见汇总表—《核酸引物探针质量技术要求》标准征求意见稿。”
(8) 年⽉⾄⽉，标准起草⼩组根据专家意见，对标准（征求意见稿）进⾏修改和完善，形成送审稿，报全国⽣化检测标准化技术委员会⾏审定。
(9) 年⽉⽇⾄⽉⽇，全国⽣化检测标准化技术委员会就标准送审稿组织函审。
本TC全体委员⼈数为44⼈，参与投票44⼈，投票同意本标准通过审查⼈，达到3/4通过。全体委员中，有⼈为起草组成员。
(10) 年⽉⽇⾄⽉⽇，标准起草组针对函审专家提出的意见建议进⾏了汇总整理，主要是单位、格式等⼀般编辑性的建议，已按专家意见建议修改。有⼏条技术性意见修改情况如下：
(11) 年⽉⽇，会后起草⼩组对标准⽂本进⾏了进⼀步修改和完善。形成了报批稿。报全国⽣化检测标准化技术委员会。
5、国家标准主要起草⼈及其所做的⼯作
（⼆）国家标准编制原则和确定国家标准主要内容（如技术指标、参数、公式、性能要求、试验⽅法、检验规则等）的论据（包括试验、统计数据），修订国家标准时，应增列新旧国家标准⽔平的对⽐；
1、标准编制原则
中频淬火变压器本标准的编制依据GB/T 1.1-2009《标准化⼯作导则第1部分：标准的结构和编写》，并参照GB/T 6379.1-2004《测量⽅法与结果的准确度（正确度与精密度）第1部分总则与定义》和GB/T 6379.2-2004《测量⽅法与结果的准确度（正确度与精密度）第2部分确定标准测量⽅法重复性与再现性的基本⽅法》。
2、确定国家标准主要内容（如技术指标、参数、公式、性能要求、试验⽅法、检验规则等）的论据（包括试验、统计数据）标准起草组查阅研究了国内外标准、企业标准、分析报告，分别咨询了英芮诚、⽣
⼯、海狸、天根、领骏、通⽤等主要磁珠及试剂盒⽣产商，并进⾏了有效沟通交流，对各个⼚商的出⼚报告单、产品说明书、质检报告中磁珠的参数和指标及相关信息进⾏了汇总整理研究，磁珠产品的合成报告单上信息包括10余种（详见表1），各⼚商标注参数差异较⼤，并⽆统⼀参考标准和指导⽂件。
表1.典型⼚家磁珠及磁珠试剂盒检测参数⼀览表
项⽬组经对各参数进⾏复现和验证，并与多家试剂⼚家和⾏业专家进⾏详细沟通交流讨论后，经过响应⾯试验研究决定确定的影响因素和参数包括：完全磁分离时间、重分散性、磁稳定性、DNA浓度和纯度、DNA得量、DNA完整性、稳定性、回收率、精密度等。
（三）主要试验（或验证）的分析、综述报告，技术经济论证，预期的经济效果；
1、实验材料及仪器
1.1.1总体要求
除⾮有特殊说明，仅使⽤分析纯试剂和符合GB/T 6682规定的⼀级⽔。
1.1.2 DNA提取试剂盒（磁珠法）
1.1.3 DNA标准品
1.2 溶液
段远程1.2.1 6×上样缓冲液：含0.25%溴酚蓝，0.25%⼆甲苯青FF，30%⽢油⽔溶液。
1.2.2 TAE电泳缓冲液：50×TAE Buffer 配制⽅法：称取Tris 242 g，EDTA 18.612 g于1 L 烧杯中，向烧杯中加⼊约800 mL去离⼦⽔，充分搅拌均匀，加⼊57.1 mL的冰⼄酸，充分溶解，⽤NaOH调pH⾄8.0，加去离⼦⽔定容⾄1 L后，室温保存。使⽤时稀释50倍或100倍即1×TAE Buffer。
1.3 仪器
1.3.1 涡旋震荡仪。
1.3.2移液器。
1.3.3磁⼒架、⾃动化核酸提取仪或⼯作站。
1.3.4微量紫外分光光度计或酶标仪。
试水接头
1.3.5荧光定量计。
1.3.6电泳仪。
1.3.7凝胶成像系统。
1.3.8荧光定量PCR仪。
2、实验⽅法
2.1基本要求
采⽤⾄少3个不同批次的试剂盒，每⼀批次的试剂盒分别对20份阴性控制样品、20份加标样品进⾏提
取纯化。加标样品的加标浓度与试剂盒提供的临界控制值⼀致。同时采⽤参考⽅法进⾏检测。结果表⽰按照SN/T 2775的规定执⾏。
2.2 试剂盒外观
检查试剂盒外包装是否存在破损，标识是否清晰，内容物是否齐全，材料附着是否牢固；磁珠悬浮液为⿊⾊、棕⾊或者棕黄⾊悬浊液，其他组分应符合说明书描述。
2.3 磁珠法DNA提取纯化
根据磁珠法DNA提取纯化试剂盒说明书进⾏。
2.4 完全磁分离时间
将磁珠磁性分离进⾏计时。
2.5 重分散性将磁珠分散在缓冲液中，超声5 min ，振荡混匀，将此磁珠分散液于离⼼机上采⽤3000 r/min 速度离⼼3 min ，加速沉淀，随后涡旋振荡30 s ，在已确定的吸收波长下测试分散液的吸光度值（A1），重分散率（Prd ）数值以%表⽰，按
%1000
1rd ?=A A P ····················································（2）式（2）中，
A1—离⼼后磁珠重悬液的吸光度；
A0—磁珠分散液的吸光度。
2.14 磁稳定性
将磁珠，分散在缓冲液（不含有铁离⼦）中，超声5 min ，并在37 ℃下以200 r/min 振荡5 h ，磁分离后取上清分散液，按GB5009.268中第⼆法规定检测游离铁离⼦浓度。磁珠不应该有铁离⼦溶出。
2.15 DNA 浓度和纯度检测
2.15.1 紫外吸收法（⼤量DNA 检测）
针对从动物组织、植物组织、⾎液、⾎斑、⾎凝块、唾液、⼝腔拭⼦、尿液、细菌等⽣物样本中提取的DNA 的浓度和纯度检测，参照GB/T 34796 的规定执⾏。
注：检测时应使OD260值在0.15到1.0之间，该⽅法仅适⽤于DNA 浓度⼤于0.25 µg/mL 。A 260/A 280 ⽐值会受pH 影响，建议使⽤10 mmol/L Tris ·HCL （pH 8.5）缓冲溶液作为检测溶剂，并作空⽩对照。
2.15.2 荧光法（微量DNA 检测）
参照2015版《中华⼈民共和国药典》第四部执⾏。
2.15.3 琼脂糖电泳测量法
质粒DNA 及微量DNA ⽚段的浓度可与已知浓度的DNA 同时进⾏电泳，根据结合的溴化⼄锭荧光强度，估计其含量。
2.15.4 荧光定量PCR 法
2.15.4.1引物和探针
18SrRNAF: CCTGAGAAACGGCTACCA
18SrRNAR: CGTGTCAGGATTGGGTAAT
18SrRNAP: FAM-TGCGCGCCTGCTGCCTTCCT-BHQ1
2.15.4.2 实时荧光PCR 反应
实验设置6个标准品DNA浓度，即100 ng/µL，10 ng/µL，1.0 ng/µL，0.1 ng/µL，0.01 ng/µL，0.001 ng/µL。每个标准品浓度设置五个，每个样品设置2个重复。
25 µL反应体系：DNA模板：2 µL ，qPCR Taq Mix : 12.5 µL ，18SrRNAF（10 µmol/L）:1 µL ，18SrRNAR（10 µmol/L）:1µL ，18SrRNAP（10 µmol/L）:1 µL ，超纯⽔:7.5 µL 。
实时荧光PCR 反应参数为：50℃/2min；95℃/10min；95℃/15s，60℃/60s，40 个循环。
注：以上参数可根据不同型号实时荧光PCR仪和所选PCR扩增试剂体系不同作调整。
2.15.4.3建⽴标准曲线绝对定量
以标准品拷贝数的对数值为横坐标，以测得的CT值为纵坐标，绘制标准曲线，对未知样品进⾏定量时，根据未知样品的CT 值，即可在标准曲线中得到样品的拷贝数。
2.15.5 其他
针对从⾎浆和⾎清中提取的病毒DNA、cfDNA和ctDNA等微量DNA产物，不适⽤于进⾏纯度检测。
2.16 DNA产物得量检测
2.16.1基本原则
根据说明书推荐的提取样本⽤量选取⾄少3个样本⽤量梯度，需涵盖最少⽤量和最多⽤量（如⼈新鲜⾎液试剂盒推荐⽤量为100 µL -250 µL，选取梯度可为100 µL,200µL，250 µL 三个⽤量梯度），参照试剂盒使⽤说明书进⾏DNA提取，参照GB/T 34796 的计算得量，得出对应样本⽤量的得量范围。常⽤试剂盒样本提取⽤量和得量可参照附表A.1。
2.16.2 基因组DNA
针对从⾎液、⾎斑、⾎凝块、⾎浆、唾液、⼝腔拭⼦、尿液、动植物组织等⽣物样本中提取的“基因组DNA”，使⽤微量紫外分光光度计，通过测量OD值进⾏DNA得量检测，具体要求和步骤参照GB/T 34796 的规定执⾏。
2.16.3 微量cfDNA或ctDNA
针对从⾎浆或⾎清样本中提取的微量cfDNA或ctDNA，建议使⽤荧光定量计，进⾏DNA得量检测。
2.16.4 微量病毒DNA
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