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大肠杆菌基因组DNA的提取及荧光定量PCR试验设计
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大肠杆菌基因组DNA的提取
一、传统法提取大肠杆菌基因组DNA。
提取DNA的一般过程是将分散好的组织细胞在含十二烷基硫酸钠（SDS）和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白质，再用酚和氯仿/异戊醇抽提分离蛋白质，得到的DNA溶液经乙醇沉淀使DNA从溶液中析出。 SDS的作用机理是由于其能结合蛋白，中和蛋白的电性，使蛋白质的非共价键受到破坏，失去二级结构，从而变形失活，蛋白酶K或链霉蛋白酶E均为光谱蛋白酶，其重要特性是能在SDS和EDTA（乙二胺四乙酸二钠）存在的情况下保持很高的活性。在匀浆后提取DNA的反应体系中，SDS可通过失活蛋白破坏细胞膜、核膜，并使组织蛋白和DNA分离；而蛋白酶K可将蛋白质降解成小肽或氨基酸，使DNA分子完整地分离出来。用酚、酚/氯仿抽提除去蛋白质，最后用无水乙醇沉淀DNA。为获得高纯度DNA，操作过程中常加入RNaseA除去RNA。CTAB（十六烷基三乙基溴化铵）是一种去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中（0.7 mol/L NaCl）是可溶的，当降低溶液盐浓度到一定的程度（0.3 mol/L NaCl）时，从溶液中沉淀，通过离心就可将CTAB-核酸的复合物与蛋白，多糖物质分开。最后通过乙醇或异丙醇沉淀DNA，而CTAB溶于乙醇或异丙醇而除去。
2、实验试剂与仪器
1）实验材料：大肠杆菌
2）实验试剂：
LB液体培养基，TE溶液，10%SDS，蛋白酶K，5mol/L NaCl， CTAB/NaCl溶液，酚/氯仿/异戊醇，异丙醇，70%乙醇
3）实验仪器：恒温摇床、低温离心机、微量移液器、水浴锅
3、溶液配制
1）LB液体培养基：细菌培养用胶化蛋白胨10 g/L，细菌培养用酵母提取物5 g/L，NaCl 10g/L，去离子水。
坐垫纸(搅拌溶解后，用5mol/LNaOH调pH至7.0.用去离子水定容100ml，用20/50ml摇瓶分装5瓶，包扎好，在121℃，1.034×105 pa高压下蒸汽灭菌20min.)
2）TE缓冲液：
1M Tris 溶液（取Tris242.2g，加ddH2O至1600ml，加热溶解）
1M tris-HCl pH8.0 溶液（取 1M Tris 溶液160ml用分析纯盐酸调至Ph=8.0（需浓盐酸约8.5ml），加ddH2O定容至200ml，高压灭菌备用）
TE缓冲液（10 mM Tris-HCl 1Mm EDTA pH=8.0，1M Tris-HCl Buffer PH=8.0 5ml
0.5M EDTA PH =8.0 1ml向烧杯中加入约400mldd H2O均匀混合;将溶液定容到500ml后，高温高压灭菌，室温保存）
3）蛋白酶K：（20mg蛋白酶K溶于1ml无菌双蒸水，-20℃备用）
黄粉虫筛选机4）CTAB/NaCl溶液：（5% w/v，5gCTAB溶于100ml 0.5M NaCl溶液中，需加热到65℃使之溶解，然后室温保存）
4、实验方法步骤
1、将大肠杆菌接种到灭菌好的LB培养基中，一级培养过夜，以10%的接种量进行二级培养，培养至对数期（4-6h）。
2、取菌液1.5ml置于离心管中，以5000rpm冷冻离心1min，弃上清液
3、加190 ul TE悬浮沉淀，并加10 ul 10%SDS,摇匀直至溶液变粘稠
4、加入1ul蛋白酶K（20mg/ml），混匀，37℃保温1小时。
涨紧轮
5、加30ul 5 mol/L NaCl,混匀。
6、加30ul CTAB/NaCl溶液，混匀，65℃保温20min
7、加入300ul酚/氯仿/异戊醇抽提（25：24:1），5000rmp离心10min
8、取上清液，加入300ul氯仿/异戊醇（24:1）抽提，5000rmp离心10min
9、取上清液，加入300ul的异丙醇，颠倒混匀，室温下静止10min，沉淀DNA，5000rmp离心10min
10、加500ul 70%乙醇洗沉淀，5000rmp离心10min
11、弃上清液，待酒精挥发尽后加30ulTE溶解
12、溶解于20ul TE中，-20℃保存。
二、试剂盒法提取大肠杆菌基因组DNA。
细菌基因组DNA提取试剂盒：
1、TGuide细菌基因组DNA提取试剂盒
DP302-02 50次 420元
2、TaKaRa细菌基因组DNA小量纯化试剂盒
水下光缆TaKaRa DV810A 50 650元
3、Biomiga 细菌基因组DNA提取试剂盒
GD2411-01 Bacterial gDNA kit 50次 423元
GD2411-02 Bacterial gDNA kit 250次 1798元
4、Biospin 细菌基因组 DNA 提取试剂盒增白皂
BSC12S1 50次 400元
BSC12M1 100次 750元
5、OMEGA细菌基因组DNA提取试剂盒
D3350-00 E.Z.N.A.TM Bacterial DNA kit 5 210元
D3350-01 E.Z.N.A.TM Bacterial DNA kit 50 980 元
D3350-02 E.Z.N.A.TM Bacterial DNA kit 200 3350元
荧光定量PCR试验（标准曲线法）
定量实验是一种实时实验，用于在聚合酶链反应 (PCR) 的每个扩增循环期间测定靶核苷酸序列 （靶）数量。其中靶可以是 DNA、 cDNA 或 RNA。 【实验原理】
在实时定量实验中，反应是在 PCR 产物的扩增达到固定荧光水平时的循环期间时间点来
描述的，而不是在固定循环次数后累积的 PCR 产物最终数量来描
述。扩增曲线以图形形式显示在执行的循环次数中检测到的荧光。
在 PCR 的最初几次循环中，荧光信号没有明显变化。该预定义的 PCR 循环范围称为基线。首先，软件通过计算归一化报告荧光信号强度 （与基线循环相对应的 Rn 值）的数学趋势，生成一个基线简化扩增曲线。然后，算法将搜索扩增曲线上基线校准后归一化报告荧光信号强度 （ delta Rn [∆Rn] 值）与阈值交叉的点。 ∆Rn 值与阈值交叉的分数循环定义为 CT。运动水袋
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