总 RNA 提取常见问题分析
Q：RNA 降解
A：
1. 新鲜细胞：如果试剂没有问题，且外源性污染也可以排
除，那么降解几乎都来自裂解液的用量不足。如 果将裂 解液直接加入培养皿中裂解细胞，一定要使裂解液能覆盖
住细胞。
2. 新鲜组织：某些富含内源核酸酶的样品(如肝脏，胸腺 等)，即使使用电动匀浆器匀浆也不能避免 RNA 的降解。更 可靠的方法是：在液氮条件下将组织研碎，并且匀浆时使
用更多裂解液。
3. 冷冻样品：样品取材后应立即置于液氮中速冻，然后移
至-70℃冰箱保存。样品决不能未经液氮速冻而直接保存于
-70℃冰箱中。冷冻样品，即使是冷冻细胞，如果不在液氮
条件下研磨碎，而直接加入裂解液中匀浆，RNA 也比新鲜样
品更容易降解。样品在与裂解液充分接触前决不能出现融
化，所以研磨用具必须预冷，在碾磨过程中要及时补充液
氮。样品研碎后，在液氮刚刚挥发完时，将样品迅速转移
到含裂解液的容器中，立即混匀匀浆。
4. 外源 RNA 酶的污染：试剂，器械及实验环境中的 RNA 酶
进入实验系统。
5. 内源 RNA 酶的污染：抑制剂失效或者用量不够，实验样
品过多；匀浆时温度过高。
Q：OD260/OD280 比值偏低
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A：
1. 蛋白质污染：确保不要吸入中间层及有机相。减少起始
样品量，确保裂解完全、彻底。加入氯仿后首先要充分混
匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。如果所得 RNA
的 OD260/OD280 比值偏低，则用氯仿重新抽提一次，再沉
淀，溶解。
2.苯酚残留：确保不要吸入中间层及有机相。加入氯仿后
首先要充分混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。
3.多糖或多酚的残留：一些特殊的组织和植物中，多糖、
多酚含量较多，这些残留也会导致 OD260/OD280 比值偏低
。因此，从这类材料中提取 RNA 时，需要注意多糖、多酚
杂质的去除。
4.设备限制：测定 OD260 及 OD280 数值时，要使 OD260 激光切割烟雾净化器读
数在 0.1-0.5 之间。此范围线性最好。用水稀释样品：测 O
D 值时，对照及样品稀释液请使用 10mM Tris，pH7.5。用
水作为稀释液将导致比值偏低。
Q：RNA 提取得率低
A：
1.www.621mm 该组织或者细胞中 RNA 含量偏低：不同细胞和组织中 RN
A 的丰度不同，如肝脏，胰腺，心脏等是高丰度组织(总 RN
A 含量 2-4μg/mg)，脑，胚胎，肾脏，肺，胸腺，卵巢等
是中丰度组织(总 RNA 含量 0.05-2μg/mg)，膀胱，骨，脂
肪等是低丰度组织(总 RNA 含量<0.05μg/mg)。
2. 组织起始量太少或者太多：样品量过少，则细胞组织中
RNA 含量较低；样品量过多则可能超过裂解液的裂解能力，
裂解将不完全，从而导致 RNA 得率低。
Q: 未提出质粒或质粒得率较低，如何解决？
A:
1. 大肠杆菌老化：请涂布平板培养后，重新挑选新菌落进
行液体培养。
2. 质粒拷贝数低：由于使用低拷贝数载体引起的质粒 DNA
提取量低，可更换具有相同功能的高拷贝数载体。
3. 菌体中无质粒：有些质粒本身不能在某些菌种中稳定存
在，经多次转接后有可能造成质粒丢失。例如，柯斯质粒
在大肠杆菌中长期保存不稳定，因此不要频繁转接，每次
接种时应接种单菌落。另外，检查筛选用抗生素使用浓度
是否正确。
4. 碱裂解不充分：使用过多菌体培养液，会导致菌体裂解
辣椒清洗机不充分，可减少菌体用量或
增加溶液 P1、P2 和 P3 的用量。对低拷贝数质粒，提取时
可加大菌体用量并加倍使用溶液 P1、P2 和 P3，可以有助于
增加质粒提取量和提高质粒质量。
5. 溶液使用不当：溶液 P2、P3 在温度较低时可能出现浑
浊，应置于 37℃保温片刻直至溶解为清亮的溶液，才能使
用。
6. 吸附柱过载：不同产品中吸附柱吸附能力不同，如果需
要提取的质粒量很大，请分
多次提取。若用富集培养基，例如 TB 或 2×YT，菌液体积
必须减少；若质粒是非
常高的拷贝数或宿主菌具有很高的生长率，则需减少 LB 培
养液体积。
7. 质粒未全部溶解(尤其质粒较大时) ：洗脱溶解质粒时 ，可适当加温或延长溶解时间。
8. 乙醇残留：漂洗液洗涤后应离心尽量去除残留液体，再
加入洗脱缓冲液。
9. 洗脱液加入位置不正确：洗脱液应加在硅胶膜中心部位
以确保洗脱液会完全覆盖硅
胶膜的表面达到最大洗脱效率。
10. 洗脱液不合适：DNA 只在低盐溶液中才能被洗脱，如洗
脱缓冲液 EB(10mM Tris-HCl, 1mM EDTA，pH8.5)或水。洗
脱效率还取决于 pH 油菜割晒机值，最大洗脱效率在 pH7.0-8.5 间。当
用水洗脱时确保其 pH 值在此范围内，如果 pH 过低可能导
致洗脱量低。洗脱时将灭菌蒸馏水或洗脱缓冲液加热至 60
℃后使用，有利于提高洗脱效率。
11. 洗脱体积太小：洗脱体积对回收率有一定影响。随着
洗脱体积的增大回收率增高，但产品浓度降低。为了得到
较高的回收率可以增大洗脱体积。
12. 洗脱时间过短：洗脱时间对回收率也会有一定影响。
洗脱时放置 1 分钟可达到较好的效果。
Q: 质粒纯度不高，如何解决？
A:
1. 混有蛋白：不要使用过多菌体。经溶液 P1、P2、P3 处
理，离心后溶液应为澄清的，如果还混有微小蛋白悬浮物
可再次离心去除后再进行下一步骤。
2. 混有 RNA：RNaseA 处理不彻底，请减少菌体用量或加入
溶液 P3 之后室温放置一段时间。如果溶液铠甲式防护罩 P1 已保存 6 个
quantumas
月以上，请在溶液 P1 中添加 RNaseA。
3. 混有基因组 DNA：加入溶液 P2 和 P3 后应温和混匀，如
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