(54)发明名称
(57)摘要dmx512协议
本发明公开了一种HIV病毒RT-LAMP-LFD检测试剂盒及其检测方法。该检测方法是根据GenBank公布的HIV病毒序列的保守区域设计HIV RT-LAMP-LFD反应系统所需引物与探针;采用本发明人配制的RNA提取试剂提取HIV病毒RNA，使用本发明建立的RT-LAMP反应体系进行检测，依据反应体系加入的检测探针，在反应结束后利用核酸快速检测试纸判定结果。同现在HIV病毒的常用检测技术相比，本发明有助于实现早期诊断，避免漏检，有助于提高检测的灵敏性、缩短检测时间，是HIV诊断方法持续发展的主要方向。 1.一种HIV病毒RT-LAMP-LFD检测方法，其特征在于包括如下步骤:
（HIV病毒）RNA的提取:
(1)取20-35mg含有HIV病毒的血液组织，加入300-500u L裂解液匀浆，离心;
(2)取步骤(1)离心所得上清液，与等体积的70%无水乙醇混合均匀后，将混合液与玻
璃纤维素膜结合;
(3)依次用去蛋白液和漂洗液洗涤玻璃纤维素膜;
(4)用RNase free water洗脱玻璃纤维素膜上吸附的RNA;
(5)配制预反应液，所述预反应液体积为15-20 u L，包括:1.5-2.0mmol /L引物HIV-FIP,1.5-2.0mmol/L引物HIV-BIP,0.2mmol/I引物HIV-F3,0.2mmol/1引物HIV-B3,0.05-0.20umol /L探针HIV-FITC-PROBE,15-30mmol/L. pH8.5-9.5的Tris-HCl，10-25mmol/I氯化钾，10-25 mmol/1硫酸铵，5-l5mmol/I硫酸镁，0.15-0.35%Triton X-100,0.4-0.9mo1/I甜菜碱，1.5-1.8mmol/I. dNTP, 1-3U逆转录酶AMV, 手提机箱5-15U BstDNA聚合酶大片段 引物HIV-FIP序列见SEQ ID N0 :1，引物HIV-BIP序列见SEQ ID N0 :2，引物HIV-F3序列见SEQ ID N0:3，引物HIV-B3序列见SEQ ID NO:4，探针HIV-FITC-PROBE序列见SEQ ID N0 :5
(6)在16-25 u L预反应液中加入4-10 u L步骤（4）所得RNA作为模板，控制反应体系总体积为20-25u L然后在温度为60-65°C出生医学证明管理系统，反应15-65min；
LFD试纸检测:
(7)取步骤(6)所得LAMP扩增反应产物6-10 u L滴到LFD试纸的点样处，然后在
点样处前端滴上60-100 uL缓冲液，5-20分钟后根据试纸条上的显带判定检测结果。
2.根据权利要求1所述的(HIV RT-LAMP-LFD检测方法)，其特征在于:所述裂解液包括浓度为30-60mmol/L的pH7.3-7. 6 的Tris-HCl，浓度为3-6mol/L的异硫氰酸胍，以及浓度为5-10mmol /L.EDTA.
3.根据权利要求1所述的(HIV RT-LAMP-LFD检测方法)，其特征在于:所述去蛋白液包括浓度为10-50mmol/L的pH7.3-7. 6 Tri s-HCl，浓度为0. 4-0. 6mol /L异硫氰酸胍，以及体积浓度为15-30%的无水乙醇。
4.根据权利要求1所述的(HIV RT-LAMP-LFD检测方法)，其特征在于:所述漂洗液包括浓度为10-50mmol/L的pH7.3-7.6 Tris-HCL,55-150mmol/LNaCl，以及体积浓度75%的无水乙醇。
5.根据权利要求1或2或3或4所述的(HIV RT-LAMP-LFD检测方法)，其特征在于:引物HIV-FIP为5'端生物素标记引物;探针MIV-FITC-PROBE为5'端FITC标记探针:
6. 一种HIV病毒RT-LAMP-LFD检测试剂盒，其特征在于：包括RT- LAMP扩增反应液，16-20u L的RT- LAMP扩增反应液包括: 1.5-2.0mmol /L引物HIV-FIP,1.5-2.0mmol/L引物HIV-BIP,0.2mmol/I引物HIV-F3,0.2mmol/1引物HIV-B3,0.05-0.20umol /L探针HIV-FITC-PROBE,15-30mmol/L. pH8.5-9.5船舶导航的Tris-HCl，10-25mmol/I氯化钾，10-25 mmol/1硫酸铵，5-l5mmol/I硫酸镁，0.15-0.35%Triton X-100,0.4-0.9mo1/I甜菜碱，1.5-1.8mmol/I. dNTP, 1-3U逆转录酶AMV, 5-15U BstDNA聚合酶大片段，其余为RNase firee water.
引物HIV-FIP序列见SEQ ID N0 :1，引物HIV-BIP序列见SEQ ID N0 :2，引物HIV-F3序列见SEQ ID N0:3，引物HIV-B3序列见SEQ ID NO:4，探针HIV-FITC-PROBE序列见SEQ ID N0 :5
7.根据权利要求6所述的HIV RT-LAMP-LFD检测试剂盒，其特征在于: 引物HIV-FIP序列见SEQ ID N0 :1，引物HIV-BIP序列见SEQ ID N0 :2，引物HIV-F3序列见SEQ ID N0:3，引物HIV-B3序列见SEQ ID NO:4，探针HIV-FITC-PROBE序列见SEQ ID N0 :5
8.根据权利要求6所述的HIV RT-LAMP-LFD检测试剂盒，其特征在于:HIV病毒LAMP-LFD检测试剂盒还配有LFD试纸用的缓冲液、阳性对照样品和阴性对照样品，其中LFD试纸用的缓冲液为1xTAE缓冲液，阳性对照样品为HIV基因组病毒RNA，阴性对照样品为无核酸的RNase firee water
HIV病毒RT-LAMP-LFD检测方法及其检测试剂盒
技术领域
[000l] 本发明涉及哺乳动物病毒检测领域，特别涉及一种人体HIV病毒RT-LAMP-LFD检测方法及其检测试剂盒。
背景技术
[0002] HIV即人类免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus，HIV），顾名思义它会造成人类免疫系统的缺陷。1981年，人类免疫缺陷病毒在美国首次发现。它是一种感染人类免疫系统细胞的慢病毒（Lentivirus），属反转录病毒的一种。至今无有效疗法的致命性传染病。该病毒破坏人体的免疫能力，导致免疫系统失去抵抗力，从而导致各种疾病及癌
症得以在人体内生存，发展到最后，导致艾滋病（获得性免疫缺陷综合征）
[0003]研究表明，人类免疫缺陷病毒直径约120纳米，大致呈球形。病毒外膜是类脂包膜，来自宿主细胞，并嵌有病毒的蛋白gp120与gp41；gp41是跨膜蛋白，gp120位于表面，并与gp41通过非共价作用结合。向内是由蛋白p17形成的球形基质（Matrix），以及蛋白p24形成的半锥形衣壳（Capsid），衣壳在电镜下呈高电子密度。衣壳内含有病毒的RNA基因组、酶（逆转录酶、整合酶、蛋白酶）以及其他来自宿主细胞的成分。其序列已测定并在GenBank上登录(登录号分别为AY222839, AY222840)。目前该病毒的检测方法有电镜法、RT-PCR检测法、TAS-FLTSA检测法等，但在实际检测工作中，现有的检测技术存在以下问题:一是灵敏度小，无法检测到潜伏感毒样品;二是容易产生假阳性，对模板质量要求高;三是操作繁琐，对实验条件要求高。
[0004] RT-LAMP是一种新型的核酸等温扩增检测技术，即依据环介导等温核酸扩增技术的原理，针对靶基因的特定区域设计4条特异性引物，利用一种具有链置换特性的DNA聚合酶和AMV逆转录酶的同时作用下，使RT和LAMP反应在同管中同时进行，简化了操作步骤，在等温条件下就可以高效、高特异地扩增靶序列。LAMP产物的检测一般采用琼脂糖凝胶电泳、浊度观察、荧光染料观察等方法。
[0005]侧向流层析试纸(lateral flow dipstick, LFD)是一种检测产物的新方法，利用反应体系中的FITC标记的探针与生物素标记的LAMP扩增产物特异性杂交，减少了电泳环节、染料颜的人为目测差异以及由非特异性扩增造成的假阳性问题.LFD检测相对于其他检测手段，有操作简便且安全的特点。LAMP-LFD反应结果可以直接肉眼观察。LFD试纸上有质控带和检测带，两条带都显表示阳性，只有质控带而检测带未显表明检测结果为阴性。该方法具有安个、快捷、高效、高灵敏度且无高的实验条件要求，适合应用推广。目
前，该技术在艾滋病病毒(HIV)的检测中未见报道。
发明内容
[0006]本发明的目的在于是提供一种应用环介导恒温扩增技术结合谱侧向层析试纸
来检测艾滋病病毒(HIV)的方法，特异性强，敏感率高。
[0007]本发明另一目的在于提供一种用于上述方法的检测试剂盒，该试剂盒特异性强，
敏感率高，而且操作简便快捷，克服现有检测方法不能在检查中直接应用的问题，适合艾滋病病毒(HIV)的筛查与预防。
[0008]本发明解决其技术问题所采用的技术方案是:
一种艾滋病病毒(HIV)RT-LAMP-LFD检测方法，包括如下步骤:
病毒RNA的提取:
(1)取20-35mg含有HIV病毒的血液组织，加入300-500裂解液匀浆，离心;
(2)取步骤(1)离心所得上清液，与等体积的70%无水乙醇混合均匀后，将混合液与玻
璃纤维素膜结合;
(3)依次用去蛋白液和漂洗液洗涤玻璃纤维素膜;
(4)用RNase free water洗脱玻璃纤维素膜上吸附的RNA;
所述预反应液体积为15-20 u L，包括:1.5-2.0mmol /L引
物HIV-FIP,1.5-2.0mmol/L引物HIV-BIP,0.2mmol/I引物HIV-F3,0.2mmol/1引物HIV-B3,0.05-0.20umol /L探针HIV-FITC-PROBE,15-30mmol/L. pH8.5-9.5的Tris-HCl，10-25mmol/I氯
化钾，10-25 mmol/1硫酸铵，5-l5mmol/I硫酸镁，0.15-0.35%Triton X-100,0.4-0.9mo1/I甜菜碱，1.5-1.8ctp版材mmol/I. dNTP, 1-3U逆转录酶AMV, 5-15U BstDNA聚合酶大片段 引物HIV-FIP序列见SEQ ID N0 :1，引物HIV-BIP序列见SEQ ID N0 :2，引物HIV-F3序列见SEQ ID N0:3，引物HIV-B3序列见SEQ ID NO:4，探针HIV-FITC-PROBE序列见SEQ ID N0 :5
(6)在16-25 u L预反应液中加入4-10 u L步骤（4）所得RNA作为模板，控制反应体系总体积为20-25u L然后在温度为60-65°C，反应15-65min；
LFD试纸检测:
(7)取步骤(6)所得LAMP扩增反应产物6-10 u L滴到LFD试纸的点样处，然后在
点样处前端滴上60-100 uL缓冲液，5-20分钟后根据试纸条上的显带判定检测结果。
[0009]本发明的检测方法是根据GenHank公布的艾滋病病毒(HIV)序列的保守区域设计了HIV病毒RT-LAMP-LFD反应系统所需引物与探针;病毒RNA提取病毒RNA，使用本发明建立的RT-LAMP-LFD反应体系进行检测，依据反应体系中加入的检测探针，在反应结束后利用核酸快速检测试纸判定结果，结果显示在61℃ 30min, HIV病毒RNA获得了高效特异性扩
骨膏
增。同现在HIV病毒的常用检测技术相比，本发明有助于实现早期诊断，避免漏检，有助于提高检测的灵敏性、缩短检测时间，是HIV诊断方法持续发展的主要方向。
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