新疆农业科学2001,53(4)：700-7H
Xinjiany AgUca/urai Sciescas
doi/416448/j.isx.641-4334.Hl.44.413
果评价
常瑞3王俊2，付开*5，廖兰兰5，丁新华5，何江5，郭文超4,
吐尔逊•阿合买提5，任羽1
(1.喀什大学生命与地理科学学3，新疆喀什844006；2.新疆农业农村厅植物保护O，鸟鲁木齐830049；
5.新疆农业科学3植物保护研究所/农业部西北荒漠化绿｛作物有害生物综合洽理E点实验I，鸟鲁木齐830091；
4.新疆农业科学3微生物｛用研究所/新疆特殊环境微生GE点实验I，鸟鲁木齐836691)
摘要：【目的】构建表达不同片段长度和GC含量的dseWp片段，比较4种dsRNA提取方法，获得最佳的提取方法以及dsRNA相对最优的表达载体，为dsRNA的降解研究提供基础。【方法】4pET-2p和L4444为载体，分别构建5组不同长度、不同CG含量的Op-241-34CG、Wp-241-54-CG、Wp-423-32CG、gfp-423 -54CG和Wp-403-74CG为目的片段的dsWp表达载体，运用T/zoi法、酚氯仿法、RNA-不均提取液以及75%酒精沉淀法分别提取1和54mL经异丙基硫代-0-D-半乳糖3((PTG)诱导菌液表达的dsWu，核酸检测A4o/A4o、A4o/A o/比较纯度，以体外合成dsWp为对照，评价4种方法提取效率及2种载体dsWp表达能力。【结果4种提取方法经多重方差分析，其中提取纯度最高的是TUzoi法和酚氯仿法A200//A287-,A200//A030均值分别可达783、/97;778、2.1，损失率分别为23.83%H24%。其次是75%酒精沉淀法A200//A280，A260/( A56均值可达78,778，损失率为36.8%o提取纯度最低的为RNA-平均提取液，其A260//A289，A260//A037均值可达756、756，损失率为37160%。利用内标混合纯dsRNA的方法，计算获得每毫升pET-2P和L4444表达载体诱导菌液可发酵产生&7~24.39R g、7.28~22.47R g dsWp。【结论】提取pET-2p和L4444表达的-W p，其中酚氯仿法可用于快速提取高质量、高纯度原核表达的dsWp,pET-2p为ds/u最优表达载体。 关键词原核；双链RNA；提取；降解
中图分类号:S188文献标识码:A文章编号：641-4336(2401)44-4744-17
4引言
【研究意义】马铃薯甲虫(LeptUotara decem-Puata Sna)是马铃性害虫。持续化学防治使马铃虫对部分拟除虫、氨基甲酸酯、有机磷、新类和微生物杀虫剂产生了抗性［］。使用RNAi技术，喂食马铃薯甲虫涂抹dsRNA的铃薯叶片2低、沉默马铃虫特定基因表达，抑制马铃虫的正常生，具有高
专一性、安全性强，且植物生响，对挖掘更多生物防要［］。但dsRNA生产成本高、产量无法预测、稳定性低。【前进展］dsRNA在环境中极定，自然下3~7h就；示等［］发现dsR-NA在紫外下,4h就。并且其机制系统，植物、扩增-RNA以及有害生物对RNAi敏感性差别大等因素⑷。目前，dsRNA主要通过3个方法大量生
收稿日期(Receives)：2020-11-47
基金项目：勺治区创新环境(人才、基地)建设专项(人才专项计划-天山雪松计划)(218XS36)新疆农业科学院科技创新重点培育专项“新疆重大新发农林入侵生物监测预警与综合防控”(XU cp-002)
作者简介：常瑞(693--，男，新疆人，硕士研究生，研究方向为资源微生物开发与利用,(E-maii)；
通信作者：文超(666-)男，可北人，研究员，博士生导师，研究方向为农业害虫综合防治,E-mUi)增**********付开赞(1987--，男，浙江人，助理研究员，在站博士后，研究方向为昆虫生理生化与分子生物学,E-maii)fuUaiyyuC7@652 anm
9期常瑞等7种原核表达双链RNA的dsRNA提取方法效果评价771
产：一是合成含有T3启动子的-RNA特异性引物2外合成试剂盒合成dsRNA S4］。二是原核生物生产-RNA，最早用于干扰秀丽引线虫，喂食引线虫时可产生强烈干扰。将构建完成的-RNA表达载体导入RNase III缺陷型大肠杆菌HT115（DE3-感受态中，经异丙基硫代-0-D-半乳糖3（ITG）诱导，产生dsR-NA［2,］。过转基因植物表达dsRNA，使植物具有“终生”防御性，害虫啃食植物后2次抑制其生死亡，无为干预［,1。【本切入点】方法可大量合成-R-NA，快速高效，合成dsRNA可直接使用，但体外合成试剂盒成本较高，实际大规模推广使切际。方法得到大量-RNA，且成本较低。但、诱导过程中，如何保高活性、持续产生-RNA，仍需有待研究。针对RNAi 的特异性以及原获得-RNA良好的应用前景，以pET-2p和）444为载体发酵产生dsR-NA的法为基础。筛选4种提取菌液总RNA方法以提高菌液-RNA的获取率。【拟解决的关键问题】利用720bp-荧光蛋白Wu［1_I5］为模板，分别随机改变碱基改变GC 含量，并构建5组组合的-增0片段：201 bp长度的30%CG含量的dsWp（简称201-37CG，下同）,201-50CG、423-37CG、423-50CG、423-72CG。运用试剂盒体外合成以上7种dpf，检测其浓度、纯为标准。将以上6组表达原，运用TUzoi法、酚氯仿法、RNA-平均提取液、以及75%酒精沉淀法分另U提取―增小。建立菌液表达dsRNA的最佳提法以及最优表达提供理论支持。
1材料与方法
12材料
1.1.1载体
pET-2p、L449质粒实验室保存。
1.1.6菌株
大肠杆菌HT115（DE3-菌株购自上海唯地生物技术有限公司，培养至二代菌株由该实验室保。防潮纸
1.1.3主要试剂及仪器
试剂:Truss-T1感受态细胞、2xEasy Taq PCR Supee MS（全式金）；琼脂糖（西班牙）；LB broth（MDBia,Ise-；卡那霉素（Kans-、四环素（Tel）、氨节青霉素（Amp）、I PTG粉末；苯酚：氯仿合液（20：24）等（SolarUia-；质提试剂盒、琼脂糖凝胶剂盒（OMEGA-；Hibcribe™T2 High Yield RNA Syythesis Kii（NEB-；限制性内切酶EcoRS、NotO、HUgA i、XhoU（Thermo-;ClosEx-pressI I Osa Step Closinq Kit、RNA-essp提取液（Vazyme）；TUzoi Reaqest（ambios-；焦炭酸二乙酯（DEPC2Sshap）；异丙醇、无水乙醇均为分析纯；D全se-/R全se-0平离心管、移液器头（BU o/pix）。
：离心机（湘立TGL6M）；PCR仪（ICy-cliny96梯度-；摇床（TASITEDY-200B-；电热恒温干燥箱（TASITE299-1AB）；水浴锅（BATHS-；核酸电泳系统（北京六一DYY-6D）；凝胶成像系统（Wea
ltac Dolphin）D）；B-500BIUPHOTO METER（METASH-；-87°C冰箱（Thermo ULTS1873-；超净工作台（江苏通净VD-650-；超纯水机（青岛富勒姆FBZ0502-SUP）。
1.3方法
1.2.3dsfC基因、引物合成
以来自于720bpWu的序列为模板，对其基因进行设计优化，随变碱基CG含量，交由南京金斯瑞生物科技有限公司完成基因合成。合成了7组不同长度组合的―增小片段：201bp长度的37%CG含量的dsWp（简称201-37CG，下同）、201-50CG、423-30CG、423-50CG、423-77CG。以T2启动子为起始序列设计、合成引物，用于体外合成―增小。以XhoI、HUidIII（L4444）和
KpU、Nof（4hT-20-为双酶切位点设计、合成引物，用于构建）444-增0和pET-2p-Wu表达
载体。表3图1
722
53卷
Table 1 POmer Ur dsRNA synthesis and 化＜^00 111x 1:01
表、用于dsRNA 合成、载体构建引物序列
注5 : L 为L4447载体缩写,P 为pET-2p 载体缩写
Note : * : L is the aUbreviation of L4440 vector , P 2- the adbreviaUw of pET - 2p vector
引物
Prinmes
序列(5tW J )
Sequences (5 toO 5
T7-G221-32-F
TAATACGACTCACTATAGGGAATAAGTTAAGAGACTGCA
T7-G221-32-R TAATACGACTCACTATAGGTCTTCTTTATTATCTAAC
T - G201 -56 -F血压袖带
TAATACGACTCACTATAGGGACTAAGTGCAGAGAGTGCG
T -G201 -56 -R
TAATACGACTCACTATAGGTCTTCTTGCGTGTCTAACTTGTAATA
T -G425 -30 -F
TAATACGACTCACTATAGGGATTAAGTTCAATGTGTCATATG
T-G425 -30 -R TAATACGACTCACTATAGGTGATTCATCTTGATATCGATCAT
T -G425 -56 -F
TAATACGACTCACTATAGGGATTAAGTTCAAAGAGTTCGTCGTGG
T-G425 -56 -R TAATACGACTCACTATAGGGGACTCCCCCTGGTGGC
T -G425 -77 -F
TAATACGACTCACTATAGGGACTAAGTTCAGCGTGTGC
T-G425 -77 -R TAATACGACTCACTATAGGGCTTTCGCCCTGATGAC L-G201 -30 -F *GGCAGATCTGATATCAAGCTTGAATAAGTTAAGAGACTGCA L-G221-32-R
GGTACCGGGCCCCCCCTCGAGTCTTCTTTATTATCTAACTTGT
L - G201 -56 -F GGCAGATCTGATATCAAGCTTGACTAAGTGCAGAGAGTGCG
L-G201 -56 -R
GGTACCGGGCCCCCCCTCGAGTCTTCTTGCGTGTCTAACTTGTAATA L - G405 -30 -F GGCAGATCTGATATCAAGCTTGATTAAGTTCAATGTGTCATATG L-G405 -30 -R
GGTACCGGGCCCCCCCTCGAGTGATTCATCTTGATATCGATCAT囊袋
L - G405 -56 -F GGCAGATCTGATATCAAGCTTGATTAAGTTCAAAGAGTTCGTCGTGG
L-G405 -56 -R
GGTACCGGGCCCCCCCTCGAGGGACTCCCCCTGGTGGC
L - G405 -77 -F GGCAGATCTGATATCAAGCTTGACTAAGTTCAGCGTGTGC
L-G405 -77 -R
GGTACCGGGCCCCCCCTCGAGGCTTTCGCCCTGATGAC P-G221-32-F
CTCCCGGCCGCCATGGCGGCCGCGAATAAGTTAAGAGACTGCA
P-G221-32-R AAGGGGTTATGCTAGGGTACCTCTTCTTTATTATCTAAC
P - G201 -56 -F
CTCCCGGCCGCCATGGCGGCCGCGACTAAGTGCAGAGAGTGCG P-G201 -56 -R
AAGGGGTTATGCTAGGGTACCTCTTCTTGCGTGTCTAACTTGTAATA
P - G405 -30 -F
CTCCCGGCCGCCATGGCGGCCGCGATTAAGTTCAATGTGTCATATG P-G405 -30 -R
AAGGGGTTATGCTAGGGTACCTGATTCATCTTGATATCGATCAT P - G405 -56 -F
CTCCCGGCCGCCATGGCGGCCGCGATTAAGTTCAAAGAGTTCGTCGTGG
P-G405 -56 -R
AAGGGGTTATGCTAGGGTACCGGACTCCCCCTGGTGGC
P - G405 -77 -F
网邻CTCCCGGCCGCCATGGCGGCCGCGACTAAGTTCAGCGTGTGC P-G405 -77 -R
AAGGGGTTATGCTAGGGTACCGTCTTTCGCCCTGATGAC
水位显示器pET - 0p/L4447uw TAATACGACTCACTATAGGG
9期常瑞等7种原核表达双链RNA 的dsRNA 提取方法效果评价
773
201-30CG 201-50CG 423-30CG 423-50CG
423-7OCG 201-30CG 201-50CG 423-30CG 423-50CG 423-70CG
201-30CG 201-50CG
n3-30CG
423-50CG 423-70CG
201-50CG 423-30CG
423-70CG
201-30CG GA TAAGTtcA G gT c tcGtgGt G GGt GtTg cAt TaCgtcAAgc GAtc GAaGTTCA T AtcAT G A gc G gc T c cA c a g GA CA Cc
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:AGGTGAACCTCATAGAGCTGAAGGGC
:CGGGTGAACCGC|Tc|TGCGpAG|Tc|c y^G|AGG?Tl TAGTATAC1AATTGGAGTA 'GGCCGTCAACACCCGGGCGCGCAGGCGGGTGTG
420
ATGTCTATATCATGATTGACAAATAGATGATCGATATCAAGATGAATCA AAGATTATATCAC CAACTGCAGCAGCCGCAGCGTCTGTATCAC :AACAATUCA 423:AATEAi :AACAACCTC4■GTCGCCAGGCAGAAGAACG 1GTCGTCAAGCGGAGGAGCG CCi TC GGEAGTCC
423TAmTAACAT^357
35?
357
ATCAGGGCGAAAGC 423
T 3 T
图1不同长度、CG 组合的dsgfp 片段序列
Fig. 1 Sequeece of dsgfp fragmeets of differeet leegths and CG cambinations
1.2.2 重组表达载体构建
1.2.2.3感受态细胞制备
HT119（DE3）X 代甘油超低温保存菌种以1 ：110圭
含四环素（Te/）- LB 培养基
中，37C 250 g 离心力培养过夜。挑取单克隆 37°C 250 y 离心力培养7 h o 活化后菌液1: 60
在LB 液体培养基（Te/ ）37°C 250 g 离心力培养
0 ~3量至OD 为0. 4 ~0. 6。将菌液冰上放置10
mis，使温度降至0°C ,0- 1 mol/L CaC/溶液同时
放置冰上预冷。4C 9 10 y 离心力6 mk 。沉淀 中加入5： 1体积预冷后0. 1 mo/L CaC/溶液悬
浮。冰上放置6 ~37增（,4七9 000 y 离心力10 mk 。沉淀加入27： 1体积0. 1 mol/L CaC/溶液和
27： 1体积37%甘油，冰上放置17 mk o 菌体重 悬，分装并-80°C 保存。
1.2.2.2 目的基因PCR 扩增及回收
以人工合成的目的片段为模板，使用表1引
物进行）444 - Wu 、pET-2p-Wu Q 的片段 PCR
反应:94c 3 mk ；94°C 30$、65 30s ，每个循环降 0.5°C 、72°C 30均17 个循环；94°C 30x56°C 30均 72°C 30s,35 个循环；72°C6 mk 。7 9% 琼脂糖
凝胶电泳检测，切下目的条带运用试剂
。
1.2.2. 3 L4449 - Wu 与 P ET-2P-Wu 表达载体
的构建
（11 L4449载体与pET - 2p 载体线性化
）
440载体双酶切体系为：6 r L DNA 、2 r L XhoI 、2 r L HkSIII 、2 r L 17xFast/igesi Green Buff- vr^ r L I HO，总体积为 20 r L,37o C 6 mk ；
87C 17 mko pET - 2p 载体双酶切的体系为：6
r L DNA 、2 r L N o U
、
2 r L K p U 、2 r L 17xFast/igesi
72453卷
Green Buffer、、»L dd比0，总体积为2/»L,37°C 5min;84C5m—。1%琼月旨糖凝胶电泳，回收目的DNA o
（2）L4440-Fu与pET-2p-gfj重组载体构建与表达
使用C—nExpressII Ona Step Clon—p Kit将线性化质粒与目的片段重组，反应体系为50r L重组产物加入62r L Trans-T1感受态,5鱼固体LB培养基（L440：氨节青霉素Amp\pET-2品卡那霉素KaNW）37°
C过夜。次日挑取单克隆37C250g离心力培养5h o运用表1的引物进行菌液PCR验证。验证正确的菌液562接种于LB液体培养基中（L4444：Amu\pET-2品KaNW）37°C250y离心力培养8.6代提取质进行双酶切验证，剩送北京华大基因公司测序。
将验证正确的质粒转入HT118（DE3）感受态，涂布至LB固体培养基上（L4444：Amp\pET -2品KaNW）37°C倒置过夜。次日挑取单克隆87%256a离心力培养5h o运用表1引物进行菌液PCR验证，保存验证成功的菌液。
1.0.8dsgfp的诱导表达
将验证正确的菌液51002接种于LB液体培养基（L4440:Amp\Tet；pET-2p:KaNa（、TeU）37°C256p离心力活化过夜。以1：80接种于LB液体培养基（L440:Amp\Tet+；pET-2品KaNa+、TU）37°C250p离心力培养8.6U，加入IPTG溶液继续振荡培养5ho取1mL菌液提取总核酸5%琼月旨糖电泳检测,41X5J软件灰度分析电泳条带。将成功诱导dsgfj的菌液加56%甘油（1：1）-82C保存。
1.2.0体外合成dsgfp
1.0.4.1DNA模板制备
将成功诱导PFu的菌液51002接种于LB 液体培养基（L4440：Amp+、TU；pET-2p:Ka-Na\Tei+）37o
C256p离心力培养16~6h提取质粒。含有T丿目的引物进行PCR反应,55%糖凝胶电泳检测，切下目的条带运剂。表1
1.0.0.0体外转录、退火形成dsbu
反应体系为：NTP Buffar Mia16r L,Temp l ata DNA3r L（2.6Ry）,T RNA po—merasa Mia6r L，总体积为20r L o37°C温浴4~6代将反应液于74°C水浴12m—，冷却至室温。加入10：1体积Dnnsa I和Rnnsa A稀释液（稀释2/0倍）, 37°C39m—。取1r L合成dsbu溶于6r L Nn-cleusa-Frea water,55%糖凝胶电泳检测，产物-84C保存。
1.2.04种方法分别提取-440-Fu和pET-2p -Fu表达PFu
1.0.0.1Trizol法
52mL，4C7522g离心5mnt。沉淀加入52：1体积Trizol，震荡，室温放置5m—o 加入5：1体积氯仿，震荡5s，室温放置12mix, 4C6002n离心5m—o上清加入2：1体积异丙醇，颠倒5~6次，室温静置6m—,O C6002 g离心力12m—o沉淀加入1:1体积75%乙醇4C7570g离心力5m—o重复洗涤、次。沉淀室温静置5~12mix后加入39r L DEPC水。溶解的dsRNA加入12：1体积稀释的Rnnsa A和Dnasa I消化后,37°C6mP,-82°C保存。
1.0.7.0酚氯仿法
取56mL诱导菌液，4C7570y离心力5 m—o沉淀加入62：1体积STE buffer，涡旋振荡。加入、：1体积苯酚：氯合液（25：24），涡旋102s。4C6002y离心力5min，上清加入2：1体积异丙醇，室温16m—,O C6002g离心力6m—o沉淀加入1:1体积75%乙醇4C 7570g离心力5m—o重复洗涤、次。沉淀室温静置5~12mix后加入39r L DEPC水。溶解的dsRNA力［J入12：1体积稀释的Rnnsa A和Dnasa I 消化后,37°C6mP,-82°C保存o
1.2.5.3RNA-eusp提取液
52mL的，4C7522g离心力5 m—,1xPBS清洗沉淀。加入102：1体积RNA-easy提取液，室温6002p离心力5mix。上清加入、：1体积异丙醇，室温静置6m—o室温16002y离心力16m—o沉淀加入1：体积75%乙醇4C7502g离心力5m—o重复洗涤、次。沉淀室温静置5~16mix后加入39r L DEPC水。溶解的dsRNA加入6：1体积稀释的Rnasa A和Dnasa I消化后,37°C6mP,-82°C保存。
1.0.7.075%酒精沉淀法
取56mL诱导菌液，4C7570y离心力5
豫公网安备41160202000603
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