两株高抑菌性抗生菌的抑菌性比较研究
学生姓名：罗冰科指导老师：彭玲
武汉生物工程学院生物技术系
摘要：以金黄葡萄球菌和大肠杆菌为敏感菌，以地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌为拮抗菌。测定并比较了两株目的出发菌株的抑菌效价。经过诱变和筛选，获得了比原出发菌株抑菌性明显增强的菌株。 关键词：拮抗菌；抑菌效价
0．抗生菌
抗生菌，亦称拮抗菌，指能通过产生某种或某类特殊代谢产物，具有选择性地抑制或杀死其他微生物的一些微生物。现在也将其广义称为益生菌的一种类型。两种微生物之间的这种关系为特异拮抗关系，前者称为拮抗菌，后者称为敏感菌，拮抗性物质称抗生素或抗菌素。芽孢杆菌（Bacillus）是目前抗生菌中研究较多的一类，尤其是用于饲料工业和植物病虫害防治（生防菌），主要的种类有枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌，同时这两种菌现在也称为益生菌[1]。
益生菌的有益功能是多方面的，大致归纳如下：屏障障功能、杀菌功能、营养功能、清理功能、免疫功能和防癌功能。
以芽孢杆菌为代表的益生菌，可促进人体对营养物质的吸收，提高免疫力，预防和便秘及腹泻，降血脂，抑制肠道病源和腐败微生物的生长，分解致癌物质[2]。因此，保持和促进芽孢杆菌优势和生长，是提高人们健康长寿的重要手段。正是基于以上考虑，本试验就是从普通菌种中经过诱变和筛选出具有抑制性的益生菌，以便以后发展更多的应用于生产生活中。
1．材料与试剂
1.1实验材料
1.1.1菌种：拮抗菌，地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis)(武汉生物工程学院实验室提供)和枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）(华中农业大学实验室提供)；敏感菌，金黄葡萄球菌和大肠杆菌。
1.1.2培养基：牛肉膏蛋白胨培养基
2．实验方法砂浆回收
2.1具拮抗性目的菌株的筛选
（1）平板滤纸片抑菌圈法：取敏感菌菌液200uL涂布于牛肉膏蛋白胨平板表面，静置渗透片刻，将直径为6mm的无菌小滤纸片贴在培养基相应位置，用5-50uL无菌移液吸取10uL拮抗菌液滴加在滤纸片上，37℃恒温培养24h，测量抑菌环大小。
（2）琼脂块抑菌环法：用内径6mm的无菌打孔器（可用1mL无菌移液头代替）将拮抗菌单菌落连同琼脂块取下，移于涂布有敏感菌的平板上，继续37℃恒温培养24h，测量琼脂块周围抑菌环大小。
2.2 紫外线诱变
将菌悬液4mL于9cm内有磁力搅拌器的无菌培养皿中，在暗室将平皿置于磁力搅拌器上，于波长253nm，功率15W的紫外灯下，距离30cm，照射60s后开振荡照射，于不同时间
（1min,2min,3min）分别取样于无菌试管中，并将试管放于冰水中1-2h（防光修复酶的活性）。然后将稀释后菌悬液涂布于培养基表面，于37℃恒温培养箱进行暗培养48h。待培养基表面长出单个菌落，根据菌落生长情况，选择长势较好的菌落，采用琼脂块筛选法进行筛选有抑制性的单个纯种菌落。牙箱
2.3抑菌性强弱的测定
2.3.1滤纸片抑菌圈法
取敏感菌菌液200uL涂布于牛肉膏蛋白胨，静置渗透片刻，将直径为6mm的无菌小滤纸片贴在培养基相应位置，用5-50uL无菌移液吸取10uL拮抗菌液滴加在滤纸片上，37℃恒温培养24h，测量抑菌环大小（mm）。
2.3.2牛津杯法
取敏感菌菌液200uL涂布于牛肉膏蛋白胨，静置渗透片刻，将牛津杯放在培养基相应位置，用无菌移液吸取200uL拮抗菌液滴加在牛津杯里，37℃恒温培养24h，取出牛津杯测量抑菌环大小（mm）。
3．结果分析
3.1出发菌株的抑菌性
以原出发菌株地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌为拮抗菌，以金黄葡萄球菌为敏感菌，测其抑菌性强弱。采用滤纸片抑菌圈法，实验结果如下：
表1两种拮抗菌对金黄葡萄球菌的抑菌性（滤纸片法）（D:mm）名称金黄葡萄球菌
空白液体培养基地衣芽孢杆菌枯草芽孢杆菌0 21 0
(抑菌圈直径=透明圈直径-滤纸片的直径（6mm）)
3.2紫外诱变后菌株的抑菌性
通过诱变和大量的筛选获得了具有强抑菌性的拮抗菌地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌，以这两种菌为拮
家用垃圾桶抗菌，金黄葡萄球菌为敏感菌，利用滤纸片法实验，实验结果如图1和图2：
图1：经诱变后的拮抗菌（混菌法地衣芽孢杆菌+金黄葡萄球菌）
图2：经诱变后的拮抗菌（混菌法枯草芽孢杆菌+金黄葡萄球菌）
3.3拮抗菌对金黄葡萄球菌和大肠杆菌的拮抗性比较
为了进一步测定拮抗菌的抑菌性，本实验还选择了大肠杆菌作为敏感菌。采用牛津杯法，实验对比结果如表2：
3.4结果分析
比较第一次实验和第二次实验的结果，我们不难得出以下结论：
（1）实验中应用的地衣芽孢杆菌具有很强的抑制性，而枯草芽孢杆菌经过一年的存放抑制性基本上已经退化（从华中农业大学得到的枯草芽孢杆菌有很强的抑制性），可能是如
下原因造成，第一，枯草可能已经被其他杂菌污染，不能表现出抑制性；第二，枯草芽孢杆表2 拮抗菌菌悬液对敏感菌的抑制（滤纸片法）（D：mm）
名称金黄葡萄球菌大肠杆菌
空白对照（野生型菌株）诱变后的地衣芽孢杆菌诱变后的枯草芽孢杆菌出发菌地衣芽孢杆菌
出发菌枯草芽孢杆菌 0
24
21
21
23
20
18
crpd-366
(野生型菌株来自武汉生物工程学院实验室，是没有抑制性的地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌) 菌的营养体已经死亡，只剩下芽孢；第三，突变的基因可能已经自动修复，失去抑制性。通过革兰氏染和芽孢染确定第二条可能性的存在，利用梯度稀释，纯化菌种，确实存在杂菌污染，但具体是什么还要进一步通过生理生化实验鉴定。
（2）将得到枯草芽孢杆菌梯度稀释，纯化，利用琼脂块筛选法筛选出对金黄葡萄球菌和大肠杆菌具有抑制性的菌株，然后对具有抑制性的枯草和地衣进行诱变筛选，用筛选出来的菌株继续实验，与第一实验对比，枯草具有了很强的抑制性，而地衣芽孢杆菌的抑制性基本上没有发生变化。实验结果说明，通过纯化诱变和筛选枯草芽孢杆菌恢复了抑制性，而地衣的抑制性基本上没有发生变化，可能已经是地衣的抑制性比较稳定或者是紫外线诱变没有什么效果，可以考虑其他诱变方法，例如利用化学方法诱变和多因子诱变，同时还可以把化学诱变和物理诱变结合来诱变等方法继续研究，以期得到更强、更稳定的抑制性的抗生菌。4．讨论
以上实验我们获得了具有良好抑制性的益生菌地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌，那么这些益生菌有哪些应用呢？
有报道说地衣芽孢杆菌能作为饲料添加剂，其有效成分为地衣芽孢杆菌活菌，属于益生菌的一种。1989年，美国FDA和美国饲料控制官员协会公布了可以直接饲喂且一般认为是安全的微生物菌种名单，其中包括地衣芽孢杆菌。中华人民共和国农业部318号公告也把地衣芽孢杆菌列入了饲料添加剂目录。国内外对地衣芽孢杆菌在动物领域的应用进行了大量的研究。一般认为，地衣芽孢杆菌主要从以下几个方面发挥作用：
（1）拮抗动物病原细菌并维持和调整肠道微生态平衡；
（2）产生多种酶类并提高动物消化酶活性；
（3）增强动物的免疫功能，抵御感染；
（4）促进动物器官生理机能成熟并改善动物生理状态[13]。
随着科学的不断发展，地衣芽孢杆菌的良好特性正在被人们所广泛认识。
在应用效果方面，中国农业大学动物科学技术学院与扬州大学动物科学技术学院合作，进行了肉鸡、
仔猪的饲养试验，证实了地衣芽孢杆菌具有促进畜禽生长，降低料重比；增加肠道有益菌数量，改善畜禽肠道微生态环境；预防和肠道疾病，降低死亡率的作用究证明地衣芽孢杆菌确实是一种高效、安全的新型的饲料添加剂。在人们越来越关注食品安全，迫切希望减少抗生素使用的今天，地衣芽孢杆菌制剂作为新一代新饲料添加剂必将具有广阔的前景。
具有拮抗性枯草芽孢杆菌常被研发并应用于植物病害的生物防治上。有报道说枯草芽孢杆菌在代谢过程中，至少会产生66种不同的抗生素。产生抗生素的枯草杆菌除可以将菌体直接喷洒植物叶面保护其免受叶部病害的为害，可制成粉剂或抽取纯化其抗生物质，进行种子覆被或土壤处理。枯草杆菌可同时产生分子量相近的多种抗生素，其组成成分为多个氨基酸以环状结构联接，因其较不容易被动植物的蛋白酶水解，其应用领域还有很多有待开发。
参考文献：
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北京百泰克[13] 潘康成，杨汉博.饲用芽孢菌作用机理的研究进展.四川农业大学动物科技学院.
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