近⼏年来，细菌耐药性的问题已引起了世界各国的⼴泛关注，抗⽣素的不合理应⽤甚⾄滥⽤是造成细菌耐药的重要因素之⼀[1,2]。抗⽣素的滥⽤主要表现在临床⽤药、病患者以及畜牧业使⽤不合理等 3 个⽅⾯，在畜牧业中滥⽤的问题尤为严重，正威胁着⼈类的健康[3,4]。2015 年我国史上最严《⾷品安全法》和 2016年“禁抗令”的出台，预⽰着寻开发新型、绿⾊、安全、⾼效的抗⽣素替代品已成⼤势所趋。
植物精油是⼀类植物体内的次级代谢物质，是世界公认安全性的物质。许多研究证实，植物精油凭借⾃⾝具有抗菌消炎、抗氧化、延缓衰⽼等多种⽣物活性，已被⼴泛应⽤于医疗保健、⾷品⼯业和⽇化产品等领域中[5]。⽜⾄油因其天然、⽆残留、抗菌及不容易产⽣抗药性等特点，已被我国农业部批准作为⼀种可长期添加的药物饲料添加剂[6]，从⽽说明天然植物提取物作为抗⽣素替代品是⼀种具有较⼤潜⼒的⽅向。肠道菌是⼀个由益⽣菌、条件致病菌和病原菌组成的复杂微⽣态系统，其微⽣物种类超过 1000 种。
其中益⽣菌主要有乳杆菌和双歧杆菌等，⼤肠埃希⽒菌属是肠道最为常见的引起腹泻的致病菌，肠道的病原菌还包括通过⾷⽤外界霉变的⾷物⽽进⼊肠道的霉菌，其中常见的有黄曲霉。抗⽣素主要作为抗菌素使⽤，对致病微⽣物有着良好的抑制和杀灭作⽤，适量的使⽤在肠道体内起到的主要作⽤是调节肠道菌[7]。然⽽众多资料显⽰，根据植物精油的抑菌机理可知其对任何微⽣物都会起到抑制作⽤，但是不
同活性成分的植物精油对微⽣物的抑制强度都不⼀样[8]。因此，通过植物精油间协同增效可能有助于寻出在抑制致病菌⽣长的同时对益⽣菌⽣长没有显著影响的复配植物精油，从⽽能达到抗⽣素调节肠道内菌平衡作⽤。
国内外⼀直致⼒于植物精油对致病菌抑菌活性的研究，事实证明植物精油有着⽆法⽐拟的天然抑菌功效，但是植物精油对益⽣菌⽣长影响的研究尚未见报道[9]。所以本⽂研究了不同活性成分的植物精油对常见肠道微⽣物的抑菌效果，通过植物精油间协同增效效应进⾏复配，以筛选出抑制肠道致病菌⽣长的同时对肠道有益菌⽣长没有显著影响的复配精油，并分析其化学组成成分，为开发新型绿⾊、安全、⾼效的抗⽣素替代品提供理论依据。
1、材料与⽅法
1.1、材料试验
菌种：肠产毒性⼤肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC) (K88ac 菌株)，⼴州美瑞泰科⽣物⼯程技术有限公司惠赠；肠出⾎性⼤肠杆菌(Enterohemorrhage Escherichia coli ， EHEC)ATCC35150(O157：H7)、致泻性⼤肠杆菌(Enteropathogenic Escherichia coli，EPEC)CICC 10411(O127：K63)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)ATCC 4356、两歧双歧杆菌(Bifidobacterium Bifidum)ATCC 29521、黄曲霉(Aspergillus flavus)ATCC 9643、药敏质控菌株⼤肠杆
菌(Escherichia coli)ATCC 25922 均由⼴东省微⽣物研究所提供。
植物精油(⾁桂油、⽜⾄油、百⾥⾹油、茶树油、桉叶油、薄荷油、迷迭⾹油和茴⾹油)：⼴东⾹飘三创（产学研）众创平台提供。
抗⽣素药敏⽚(四环素、阿莫西林、多粘菌素 B、卡那霉素和恩诺沙星)：杭州微⽣物试剂有限公司。
厌氧培养袋、厌氧产⽓袋、氧⽓指⽰剂：⽇本三菱⽡斯化学株式会社（INC）。
M-H 琼脂培养基、M-H 液体培养基、营养琼脂培养基、营养⾁汤、孟加拉红培养基、霉菌液体培养基、MRS 琼脂培养基、MRS 液体培养基、BBL 琼脂培养基和 BBL 液体培养基：⼴东环凯微⽣物科技有限公司。
⽆⽔⼄醇，为分析纯。
1.2、仪器与设备
YX-280D MODE 不锈钢⼿提式压⼒蒸汽灭菌锅：合肥华泰医疗设备有限公司；DHG-9140 电热恒温⿎风⼲燥箱：上海⼀恒科学仪器有限公司；SW-CJ-2F超净⼯作台：苏州安泰空⽓技术有限公司；SPX-250⽣化培养箱：上海锐丰仪器仪表有限公司；SHA-BA恒温振荡器：常州澳华仪器有限公司；GCMS-QP2010Plus ⽓相⾊谱-质谱联⽤仪：⽇本岛津公司。
1.3、实验⽅法
电力线网络摄像机1.3.1、菌悬液的制备
滤纸片法⼤肠杆菌属菌悬液的制备：先在平板上划线活化菌种，置于 37 ℃培养箱有氧培养 24 h 后，从平板上挑取单个菌落，采⽤麦⽒⽐浊法制成 0.5 麦⽒单位的菌悬液（1.5×108CFU/mL），⽤⽆菌⽔倍⽐稀释到所需浓度的菌悬液
（105~106CFU/mL），备⽤。
乳酸菌属菌悬液的制备：先在平板上划线活化菌种，与厌氧产⽓袋和氧⽓指⽰剂⼀并放⼊厌氧培养袋中，然后锁紧厌氧培养袋并观察氧⽓指⽰剂的颜⾊由蓝⾊变成粉红⾊后，再置于 37 ℃培养箱厌氧培养 48h，从平板上挑取单个菌落，采⽤麦⽒⽐浊法制成 0.5麦⽒单位的菌悬液（1.5×108CFU/mL），⽤⽆菌⽔倍⽐稀释到所需浓度的菌悬液热敏打印机芯
（105~106CFU/mL），整个操作需要在 20 min 内完成，备⽤。
霉菌孢⼦悬液的制备[19]：先在平板上划线活化菌种，置于 28 ℃培养箱培养 5~7 d，待长出孢⼦后⽤⽆菌⽔进⾏洗脱，并置于 196 r/min、28 ℃恒温振荡器中进⾏ 30 min 充分震荡，然后使⽤⾎球计数板进⾏计数，最后将孢⼦悬液稀释为105~106CFU/mL，保存在4 ℃冰箱中不超过 7 d，备⽤。
1.3.2、抑菌圈的测定
通过测定植物精油和抗⽣素对供试菌的抑菌圈来分析抗菌敏感性。先将⾼压灭菌的琼脂培养基（⼤肠杆菌属⽤ M-H 琼脂培养基、黄曲霉⽤孟加拉琼脂培养基、嗜酸乳杆菌⽤ MRS 琼脂培养基、两歧双歧杆菌⽤ BBL 琼脂培养基）的温度降⾄ 45 ℃左右，在⼲燥灭菌的直径 9 cm 培养⽫内加⼊ 15 mL 培养基，待冷却凝固后，再吸取 100 µL 的菌悬液，并⽤⽆菌涂布棒均匀涂布于相对应琼脂平⽫，备⽤。
油品分析抗⽣素组：采⽤ WHO 推荐的 K-B 琼脂扩散纸⽚法[10]。⽤⽆菌镊⼦夹取不同抗⽣素药敏纸⽚（d=5 mm）贴在含菌平⽫上，呈正三⾓形放置 3 ⽚在琼脂平板中央周围，其中 2 ⽚为抗⽣素药敏⽚和 1 ⽚为等⼤⼩的已灭菌滤纸做空⽩对照，每个纸⽚轻轻压⼀下以保证与琼脂表⾯完全接触(放置时切勿拖动)；植物精油组：采⽤琼脂孔注⼊法[11]。⽤⽆菌⾦属打孔器（d=5 mm）在含菌平板上等距离地打三个⼩孔，⽤⽆菌镊⼦剔去孔内琼脂，吸取 10 µL 不同的纯植物精油加⼊其中两个孔内，并⽤等量的⽆菌⽔加⼊第三个孔内做空⽩对照；将平⽫盖上后平置于恒温培养箱中培养(⼤肠杆菌属 37 ℃有氧培养 24 h，乳酸菌属 37 ℃厌氧培养 48h，霉菌 28 ℃有氧培养 72 h)。以⼗字交叉法测量抑菌圈直径，每个处理设3 次重复，取其平均直径。
1.3.3、最低抑菌浓度(MIC)和最⼩杀菌浓度(MBC)的测定
采⽤直接接触法。在 5 mL 相应的液体培养基中加⼊ 100 µL 菌悬液，将供试精油⽤⽆⽔⼄醇稀释配制
成 10%精油溶液，然后分别吸取不同量的 10%精油溶液加⼊装有等量液体培养基的试管中，使精油浓度为31.25 µL/L~3000 µL/L，且⽤⽆⽔⼄醇做空⽩对照，置于 196 r/min 恒温振荡器中进⾏培养，观察⽣长情况。
然后取 0.2 mL 培养液于相应的平板中进⾏涂布，倒放置于培养箱中培养(⼤肠杆菌属 37 ℃有氧培养 24 h，乳酸菌属 37℃厌氧培养 48 h，霉菌 28 ℃有氧培养 72h)，观察⽣长情况。若不长菌的最⼩精油浓度为该精油的最⼩抑菌浓度（MIC），继续培养 3 d 以上，若仍不长菌的即为最低精油浓度为最⼩杀菌浓度（MBC）。
其中每个处理设 3 次重复，本实验中精油浓度 3000µL/L 仍不能抑制细菌视为该精油对其没有作⽤。
环丙基硼酸1.3.4、复配植物精油联合抑菌效果的测定
根据单⼀植物精油的抑菌圈和最低抑菌浓度(MIC)的测定结果，选取对肠道菌抑菌效果明显的植物精油进⾏联合抑菌实验。植物精油的复配实验采⽤棋盘稀释法[12]，同时加⼊等量对应的单⼀植物精油作为对照。观察培养液倒平板后菌株的⽣长情况，记录复配精油的最⼩抑菌浓度(MIC)，实验重复 3 次。以分级抑菌浓度指数(FICI)作为联合抗菌试验效果的判定依据[12]，FICI 的计算公式如下所⽰。
判定依据[12]，FICI 的计算公式如下所⽰。
B MI
C B MIC A MIC A MIC FICI FICA FICB 单⽤时的联合时的单⽤时的联合时的= + = +FIC 指数的判断标准为：FIC<0.5 时为协同作⽤（S）；0.5≤FIC≤1 为相加作⽤（A）；1<FIC<4 为⽆关作⽤（I）；FIC≥4 时为拮抗作⽤（AN）。
1.3.5、植物精油有效成分分析
⽓相⾊谱仪条件：DB-MS ⽑细管⾊谱柱(30m×0.25 mm，0.25 µm)，载⽓为氦⽓，进样⼝温度250 ℃，分流⽐ 50:1，流速 1 mL/min，进样量 1 µL。
(⽜⾄油)升温程序：初始柱温 60 ℃，保持 3 min，以 5 ℃/min 升温速率升⾄ 300 ℃，保持 5 min。
(⾁桂油)升温程序：初始柱温 100 ℃，以 4 ℃/min升温速率升⾄ 150 ℃，保持 3 min，再以 5 ℃/min 升温速率升⾄ 280℃，保持 5 min。
质谱仪条件：EI 电离源，电⼦轰击能量 70 eV，离⼦源温度 230 ℃，四级杆温度为 150 ℃，质谱接⼝温度为 250 ℃，扫描范围 m/z 为 25~450 u。
根据总离⼦流图分离出来的各组分，利⽤WILEY275 谱库和NBS75K 标准质谱库检索，查阅质谱⼿册并根据相关⽂献进⾏化学成分鉴定，采⽤峰⾯积归⼀化法算出植物精油各种组分的相对含量。
1.3.6、数据统计分析
每个实验分别进⾏三次平⾏，并且数据以平均值（mean）±标准差（sd）表⽰，⽅差分析（ANOVA）是⽤于两个及以上样本均数差异的显著性检验，p≤0.05 时说明具有统计学的意义。
2、结果与讨论
2.1、植物精油抑菌活性的测定
不同活性成分的植物精油和抗⽣素对肠道微⽣物的体外抑菌效果测定结果见表 1 和表 2。按照美国临床实验室标准化委员会（NCCLS）颁布的《抗微⽣物药物敏感性试验执⾏标准》判断对药物的敏感性，抑菌圈试验的判定标准为：抑菌圈直径>20 mm 为最敏感，10 mm~20 mm 为中度敏感，5 mm~10 mm 为低度敏感，⽆抑制作⽤者（≤5 mm）为不敏感[13]。就抗⽣素组总体上看，恩诺沙星对 4 种⼤肠杆菌和两歧双歧杆菌的抑菌圈直径均>20 mm，属于最敏感；卡那霉素对各种类⼤肠杆菌的抑菌圈>20 mm，属于最敏感，对两歧双歧杆菌是中度敏感；多粘菌素 B和四环素对各种类⼤肠杆菌都为中度敏感，但对两歧双歧杆菌的抑菌圈直径均>20 mm，属于最敏感；阿莫西林对各种类⼤肠杆菌和两歧双歧杆菌抑菌直径均在10 mm~20 mm 之间，属于中度敏感。综合⽐较来看，若要筛选出具有抑制肠道致病菌⽣长的同时对肠道益⽣菌的⽣长没有显著影响效果的抗⽣素，那就是卡那霉素的效果最为明显。
就植物精油组总体上看，⾁桂油、⽜⾄油和百⾥⾹油⽆论是对肠道致病菌还是益⽣菌，都表现出较强的的抑制作⽤；桉叶油对⼤肠杆菌、肠产毒性⼤肠杆菌和两歧双歧杆菌的抑菌效果都表现为最敏感，茶树油对两歧双歧杆菌表现出较强的抑制作⽤，抑菌圈直径达到 34.0±2.6 mm，属于最敏感，⽽对黄曲霉和嗜酸乳杆菌仅表现出低度敏感；薄荷油对两歧双歧杆菌的抑菌圈直径>20 mm，属于最敏感，对其他 6 种供试菌均为中度敏感，迷迭⾹油对肠产毒性⼤肠杆菌的抑制效果较强，对⼤肠杆菌和两歧双歧杆菌的抑菌作⽤表现为中度敏感，对其他两种菌的抑制作⽤不明显；茴⾹油只有对两歧双歧杆菌表现出中度敏感，对其他菌种都是低度敏感。综合来看，上表中的植物精油要么对所有的试验菌同时起较强或较弱抑制作⽤，要么只对特定菌种上表现出较强的抑菌作⽤；没有⼀种精油对肠道致病菌起较强抑制作⽤同时，对肠道益⽣菌⽣长没有明显的影响，这与 Joris 等[14]研究结果相同。
综合⽐较来看，就肠道致病菌的抑制效果⽽⾔，抗⽣素和植物精油都具有对各种类⼤肠杆菌肠杆菌较强的抑菌效果，但植物精油⽐抗⽣素多具有对黄曲霉更强的抑菌效果，表明植物精油具有有效减少误⾷黄曲霉⾷品对肠道产⽣危害的潜能；抗⽣素的抑菌圈直径值的标准偏差均⽐植物精油的⼩，结果产⽣的差异可能是由两者⾃⾝的性质决定的，抗⽣素是⽔溶性且不挥发，⽽植物精油具有挥发性的同时不是⽔溶性的，所以抗⽣素得出的抑菌圈直径结果⽐植物精油的较为稳定。
2.2、植物精油最低抑菌浓度(MIC)和最⼩杀菌浓度(MBC)
为了解选⽤的不同活性成分的植物精油对肠道常见微⽣物的抗菌效果，通过直接接触法测定各植物精油的最低抑菌浓度
为了解选⽤的不同活性成分的植物精油对肠道常见微⽣物的抗菌效果，通过直接接触法测定各植物精油的最低抑菌浓度(MIC)和最⼩杀菌浓度(MBC)研究其抑菌效果。其中最⼩抑菌浓度（MIC）为减少 90%微⽣物菌落的最低精油浓度，⽽最⼩杀菌浓度（MBC）为杀死 99.9%微⽣物菌落的最低精油浓度。⼋种植物精油对致病菌和益⽣菌的MIC 和MBC 的测定结果分别见表 2 和表 3 所⽰。由表 2 和 3 可知，⼋种植物精油对 7 种供试菌种的⽣长都有不同程度的抑制作⽤，其中抑菌效果较好的是⾁桂油、⽜⾄油和百⾥⾹油，对 5 种致病菌的MIC 值均≤500 µL/L，对2种益⽣菌的 MIC 值均
≤700µL/L；这三种植物精油都表现出了⼴谱抑菌性，在对肠道致病菌有较强抑制作⽤的同时对肠道益⽣菌也有着较强的抑制作⽤，⽽相对于⽜⾄油和百⾥⾹油，⾁桂油对黄曲霉和两歧双歧杆菌的抑菌效果较为明显，分别为 125 µL/L 和500 µL/L，其次是⽜⾄油和百⾥⾹油；⾁桂油对⼤肠杆菌和嗜酸乳杆菌的 MBC 值均⽐⽜⾄油和百⾥⾹油的低，分别为250 µL/L和700 µL/L，但其对黄曲霉和两歧双歧杆菌的 MBC 值与⽜⾄油的⼀样，均分别为 500 µL/L 和 700 µL/L。另外，桉叶油与茶树油相⽐，桉叶油对肠道致病菌的抑制强度⽐茶树油强，但是对肠道益⽣菌的抑制效果不如茶树油；薄荷油对 5 种致病菌的抗菌效果⽐迷迭⾹油的抗菌效果好些，特别是对⼤肠杆菌和肠产毒性⼤肠埃希⽒菌的 MIC 值均为700 µL/L，但对 2种益⽣菌的抑菌效果⽽⾔，两者却没有明显的差异；茴⾹油对⼤肠杆菌和黄曲霉的
MIC 值能与⾁桂油、⽜⾄油和百⾥⾹油等媲美，但是其 MBC 值都较⾼，与⾁桂、⽜⾄和百⾥⾹等精油的杀菌效果存在着较⼤的差距。
植物精油的 MIC 值和 MBC 值越低，其抑菌效果就越强。⼋种植物精油对肠道致病菌抗菌能⼒⼤⼩依次为：⾁桂>⽜⾄>百⾥⾹>茴⾹>薄荷>桉叶、茶树>迷迭⾹；对肠道益⽣菌抗菌能⼒⼤⼩依次为：⾁桂、⽜⾄>百⾥⾹>茴⾹>茶树>迷迭⾹>薄荷>桉叶。
2.3、植物精油联合抑菌效果的测定
根据抑菌圈直径以及 MIC 值的测定结果，采⽤棋盘稀释法对肠道致病菌抑菌效果显著的植物精油（⾁桂油、⽜⾄油和百⾥⾹油）进⾏联合抑菌活性研究，并以 FICI 值进⾏效果评价。植物精油联合抑菌效果见表 4 所⽰。
由表 4 可知，从整体来看，⾁桂油-⽜⾄油复配组合的效果更好，对 5 种肠道致病菌都具有相加作⽤，FICI 值均≤1，⽽对肠道益⽣菌的相加作⽤不如对致病菌的强；⾁桂油-百⾥⾹油复配组合对产肠毒素⼤肠杆菌显⽰出了协同作⽤，FICI 值为 0.5，对肠出⾎性⼤肠杆菌为⽆关作⽤，对⼤肠杆菌、致泻性⼤肠杆菌、黄曲霉和嗜酸乳杆菌都表现出相加作
⽤，FICI 值均≤l；⽜⾄油-百⾥⾹油复配组合除了对⼤肠杆菌和两歧双歧杆菌的杀菌率达不到 99.9%外，
对其余供试菌表现出相加作⽤（FICI 值均≤l）。2.4 ⾁桂精油和⽜⾄精油抗菌成分分析2.4.1 ⾁桂精油的 GC/MS 分析⽤⽓相⾊谱-质谱联⽤仪对⾁桂精油进⾏分析，得到总离⼦流图共显⽰ 47 个峰，如图 1，利⽤标准质谱库检索，结合查阅质谱⼿册并根据相关⽂献核对鉴定，针对主要⾊谱峰加以确认，共鉴定出 41 种化合物，其含量占⾊谱总流出峰相对百分含量的91.05%，见表5。
由⽓质联⽤分析结果（见表 5）可知，从⾁桂精油中共分离鉴定出 41 种挥发性化合物，在已鉴定出的化合物中，含量最⾼的是⾁桂醛，相对含量为 52.17%。
⾁桂具有抗菌功效与其含有较⾼含量的⾁桂醛有关[10]，除了⾁桂醛(52.17%)外，相对含量较⾼的成分还有邻甲氧基⾁桂醛(15.18%)、⾹⾖素(2.83%)、对伞花烃(2.00%)、苯甲酸⾹叶酯(1.92%)、γ-松油烯(1.69%)、苯丙醛(1.69%)、异丁⾹烯(1.15%)、α-蒎烯(1.11%)，从表 6 可以看出，从⽜⾄精油中共分离鉴定出 25种挥发性化合物，包括 2 种酚
(53.62%)、14 种烯(28.01%)、2 种烃(8.56%)、2 种醇(6.46%)、2 种酮(0.66%)、1 种醚(0.58%)和 1 种酸(0.13%)。其中相对含量较⾼的化学成分有⾹芹酚(51.73%)、间-异丙基苯(8.50%)、γ-松油烯(7.66%)、β-松油醇(6.26%)、α-蒎烯(3.97%)、β-⽉桂烯(3.95%)、⽯⽵烯(3.81%)、氧化⽯⽵烯(2.38%)、异松油烯(1.93%)以及麝⾹草酚(1.89%)，共占总化学成分含量的 92.08%。ttbn
由表 5 和表 6 可见，不同植物源的挥发油根据其主要活性成分的不同，会表现出不同的抑菌活性，⾁
桂油和⽜⾄油的主要化学成分分别为醛类和酚类化合物。⼤量研究结果表明，⾁桂醛和⾹芹酚是醛类和酚类挥发油中抑菌作⽤最强的活性成分[16]。经 GC-MS分析鉴定的⾁桂油主要成分是⾁桂醛(52.17%)，⽜⾄油主要成分是⾹芹酚(51.73%)。根据⽬前已有报道可知，⾁桂醛抑菌杀菌的作⽤机理可能主要是醛基是⼀个亲⽔基团，易被细菌或真菌表⾯的亲⽔基吸附⽽穿⼊细胞壁，从⽽破坏细菌或真菌的细胞壁多糖结构发挥其抑菌杀菌的效果；⾹芹酚可以通过挤压开磷脂的脂肪酸链，增加细胞膜流动性和通透性，从⽽让细胞质中的离⼦流出细胞外致细胞死亡[9,17]。两者作⽤机制的不同是其表现出不同抗菌活性的原因。当⾁桂油和⽜⾄油进⾏复配时，具有相加效应，多种成分共存时可提⾼各成分单独使⽤的效果，这可能是两种或两种以上的成分相互协同作⽤的结果[18]，这需进⼀步微观的实验验证。
3、结论
植物挥发油对 7 种肠道微⽣物均有⼀定程度的抑菌作⽤，其综合抑杀菌能⼒最好的是醛类的⾁桂油和酚类的⽜⾄油，其次为酚类的百⾥⾹油。最值⼀提的是，虽然这三种植物精油对所有供试菌具有较强的抑制作⽤，但是整体来看其对肠道致病菌的抑制作⽤强于对肠道益⽣菌的抑制作⽤；⽽桉叶油、茶树油、薄荷油、迷迭⾹油、茴⾹油表现出的抗菌活性并不明显，这与抑菌圈直径测定的结果相吻合。当将抑菌效果最好的⾁桂油、⽜⾄油和百⾥⾹油进⾏复配时，整体抑菌效果最好的是⾁桂-⽜⾄复配组合，其对肠道致病菌的抑制作⽤全表现出相加作⽤(FICI≤0.75)，⽽对肠道益⽣菌的⽣长却没有影响(FI
CI=1)，为开发新型绿⾊、安全、⾼效的抗⽣素替代品提供理论依据。
没有影响(FICI=1)，为开发新型绿⾊、安全、⾼效的抗⽣素替代品提供理论依据。
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