微生物培养与分离方法 大多数细菌均可以通过人工方法培养，而衣原体和病毒的分离培养往往需要活组织、鸡胚、特殊细胞株及动物接种。只有将微生物培养出来才能对它进行研究、鉴定和应用。茶籽粉
一、接种与分离方法 根据待检标本的性质、培养目的和所用培养基的种类，采用不同的接种方法。 1．平板划线分离培养法 对混有多种细菌的临床标本，采用划线分离和培养，使原来混杂在一起的细菌沿划线在琼脂平板表面分离，得到分散的单个菌落，以获得纯种。临床送检的标本如痰、咽试子、泌尿生殖道的分泌物和粪便等细菌检验均需要借助琼脂平板划线分离目的菌。平板划线分离法通常有两种方法： （1）分区划线分离法：此法常用于含菌量较多的标本如痰、泌尿生殖道的分泌物和粪便或混合细菌的分离。先用接种环挑取标本涂布于琼脂平板1区（占培养基总面积的1/4）并作数条划线，再于2、3、4区依次划线。每划完一个区域，均将接种环烧灼灭菌1次，冷后再划下一区域，每一区域的划线均与上一区域的划线交接1~3次。一个成功分区划线的平板，培养 后分别观察1区形成菌苔，2区菌落连成线，3区和4区可分离到单个菌落。
（2）连续划线分离法：此法常用于含菌量不多的标本或培养物中的细菌分离培养。方法是先将接种物在琼脂平板上1/5处轻轻涂抹，然后再用接种环或拭子在平板表面曲线连续划线接种，直至划满琼脂平板表面。
琼脂斜面接种法
主要用于菌落的移种，以获得纯种进行鉴定和保存菌种等。用接种环（针）挑取单个菌落或培养物，从培养基斜面底部向上划一条直线，然后再从底部沿直线向上曲折连续划线，直至斜面近顶端处止。生化鉴定培养基斜面接种，用接种针挑取待鉴定细菌的菌落，从斜面中央垂直刺入底部，抽出后在斜面上由下至上曲折划线接种。
3．穿刺接种法
此法多用于半固体培养基或双糖铁、明胶等具有高层的培养基接种，半固体培养基的穿刺接种可用于观察细菌的动力。接种时用接种针挑取菌落，由培养基中央垂直刺入至距管底0.4cm处，再沿穿刺线退出接种针。双糖铁等有高层及斜面之分的培养基，穿刺高层部分，退出接种针后直接划线接种斜面部分。
4．液体培养基接种法
用于各种液体培养基如肉汤、蛋白胨水、糖发酵管等的接种。用接种环挑取单个菌落，倾斜液体培养管，在液面与管壁交界处研磨接种物（以试管直立后液体淹没接种物为准）。此接种法应避免接种环与液体过多接触，更不应在液体中混匀、搅拌，以免形成气溶胶，造成实验室污染。
5．倾注平板法
本法主要用于饮水、饮料、牛乳和尿液等标本中的细菌计数。取纯培养物的稀释或原标本1ml至无菌培养皿内，再将已融化并冷却至45~50℃左右的琼脂培养基15~20ml倾注入该无菌培养皿内，混匀，待凝固后置37℃培养，长出菌落后进行菌落计数，以求出每毫升标本中所含菌数。先数6个方格（每格为1cm2）中菌落数，求出每格的平均菌落数，并算出平皿直径，然后按下列公式计数，求出每毫升标本中的细菌数。
全平板菌落数=每方格的平均菌落数×лr2
每ml标本中的细菌数=全平板菌落数×稀释倍数
6．涂布接种法
本法多用于纸片扩散法药敏试验的细菌接种。将一定量或适量的菌液加到琼脂培养基表面，然后用灭菌的L型玻璃棒或棉拭子于不同的角度反复涂布，使被接种液均匀分布于琼脂
表面，然后贴上药敏纸片，或直接培养，本法经培养后细菌形成菌苔。
二、细菌的培养方法
根据不同的标本及不同的培养目的，可选用不同的培养方法。通常把细菌的培养方法分为需氧培养、二氧化碳培养、微需氧培养和厌氧培养四种。
1．需氧培养
是指需氧菌或兼性厌氧菌在有氧条件下的培养，将已接种好的平板、斜面、液体培养基等在空气中置35℃孵育箱内孵育18~24h，无特殊要求的细菌均可生长。少数生长缓慢的细菌需要培养3-7d甚至1个月才能生长。为使孵育箱内保持一定的湿度，可在其内放置一杯水。对培养时间较长的培养基，接种后应将试管口塞好棉塞或硅胶塞后用石蜡-凡士林封固，以防培养基干裂。
2．二氧化碳培养
某些细菌，如肺炎链球菌、淋病奈瑟菌、脑膜炎奈瑟菌、布鲁氏菌和流感嗜血杆菌等的培养，特别是在初次分离时，须在5%~10 %二氧化碳环境中培养才能生长。常用的培养法如下。
（1）二氧化碳培养箱法：二氧化碳孵箱能自动调节二氧化碳的含量、温度和湿度，培养物
置于孵育箱内阁，孵育一定时间后可直接观察生长结果。
（2）烛缸培养法：取有盖磨口标本缸或玻璃干燥器，将接种好的培养基放入缸内，点燃蜡烛后放在缸内稍高于培养物的位置上，缸盖或缸口均涂以凡士林，加盖密闭。因缸内蜡烛燃烧氧逐渐减少，数分钟后蜡烛自行熄灭，此时容器内二氧化碳含量约占5%~10%。将缸置于35℃普通孵育箱内孵育。
（3）气袋法：选用无毒透明的塑料袋，将已接种标本的培养皿放入袋内，尽量祛除袋内空气后将开口处折叠并用弹簧夹夹紧袋口。使袋呈密闭状态，执断袋内已置的二氧化碳产气管（安瓿）产生二氧化碳，数分钟内就可达到需要的二氧化碳培养环境，置于35℃孵育箱内孵育。
（4）化学法：常用碳酸氢钠-盐酸法。按每升容积称取碳酸氢钠0.4g与浓盐酸0.35ml比例，分别置容器内，连同容器置于玻璃缸内，盖紧密封，倾斜缸位使盐酸与碳酸氢钠接触而生成二氧化碳。于35℃孵育箱内孵育。
3．微需氧培养
微需氧菌培养在大气中及绝对无氧环境中均不能生长，在含有5%-6% 氧气，5%-10%二氧化碳和85%氮气的气体环境中才可生长，将标本接种到培养基上，置于上述气体环境中，3
5℃进行培养即微需氧培养法。
4．厌氧培养
厌氧菌对氧敏感，培养过程中需造成低氧化还原电势的厌氧环境。厌氧培养常用的方法有：物理法、化学法、生物法。如厌氧罐培养法、气袋法、厌氧手套箱法、需氧菌共生厌氧法等。
隔离式洗衣机微生物检验技术三、染标本检查 陶瓷灯头
细菌标本经染后，由于细菌与周围环境间在颜上形成鲜明对比，故在普通光学显微镜下可清楚地观察到细菌的形态特征（如细菌的大小、形状、排列等）和某些特殊结构（如荚膜、鞭毛、芽孢等），并可根据染反应性对细菌加以分类鉴定。
（一）细菌染的一般程序
细菌染的一般程序是：涂片（干燥）—固定—染（媒染）—（脱）—（复染）。地龙多肽1．涂片制备
血液、分泌物、排泄物、穿刺液和液体培养物，直接在载玻片上作薄膜涂片；尸检或感染动物组织，病变局部涂抹采样的棉拭子直接涂片。固体培养基上的菌落或菌苔的制片，先用接种环取一环生理盐水置载玻片中央，再用无菌接种环取少量的培养物在生理盐水中磨
匀，涂布成1cm2大小的涂面，置室温下自然干燥或远火慢慢烘干。
2．固定
目的是杀死细菌，凝固细菌蛋白及结构，便于染；促使细菌粘附在载玻片上，避免在水洗过程中被水冲掉；改变细菌对染料的通透性，有利于菌细胞内结构的染。通常用火焰加热固定，将已干燥的涂片在火焰中迅速通过3次，以手背皮肤接触玻片不烫为佳。
3循环冷却水处理．染
根据检验目的不同，选择不同的染方法进行染。染时滴加染液，以复盖标本为度。
4．媒染
凡能增强染料和被染物的亲和力，使染料固定于被染物及能引起细胞膜通透性改变的物质，称媒染剂。常用的有明矾、鞣酸、金属盐和碘等，也有用加热法促进着。媒染剂可用于初染与复染之间，也可用于固定之后或含于固定液、染中。
5．脱
凡能使已着的被染物脱去颜的化学试剂称为脱剂。常用乙醇、丙酮等作为脱剂。脱剂可以查出细菌与染料结合的稳定程度，作为鉴别染之用。
6太阳能灯笼．复染
已脱处理的细菌或其结构常以复染液作复染以便于观察。复染液与初染液的颜不同而成一鲜明对比。复染不宜太强，以免掩盖初染的颜。
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