ClinicalCancerResearch：如何通过外泌体实时跟踪器官间通讯电磁感应锅炉
大多数细胞类型释放细胞外囊泡（EV），但由于缺乏适当的模型生物，提供其生理相关性的证据仍然具有挑战性。2月11号法国PSL研究大学居里研究所在Clinical Cancer Research上发表了“多功能开瓶器Live Tracking of Inter-organ Communication by Endogenous Exosomes In Vivo”，文章中开发了一种体内模型，通过在斑马鱼胚胎中表达CD63-pHluorin来研究EV功能。成像方法和蛋白质组学分析的结合能够研究个体内源性EV的生物发生、组成、转移和摄取。 文章确定了具有外泌体特征的EV亚，以蛋白质依赖性方式从卵黄合胞体层释放到血液循环中。这些外泌体通过以清道夫受体和发动蛋白依赖性方式巡回尾静脉丛（CVP）中的巨噬细胞和内皮细胞而被捕获，内吞和降解。对外泌体生物发生的干扰影响CVP生长，表明在营养支持中的作用。总而言之，本研究代表了一种用于研究体内内源性EV功能的系统，具有高时空准确性，展示了外泌体的功能性器官间通信。
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亮点
1、单个内源性EV可以在斑马鱼胚胎中用CD63-pHluorin进行活体可视化
2、YSL中的Syntenin调节外泌体释放到血液中以进一步传播小型振动器
3、YSL外泌体被胚胎尾部的巨噬细胞和内皮细胞摄取
4、摄取是清道夫受体和发动蛋白依赖性并提供营养支持
研究思路
自救手环
Figure 1:（A）显示异质细胞外囊泡的3dpf斑马鱼胚胎的电子显微镜分析。 （B）通过从AB.9成纤维细胞的上清液中超速离心纯化的外来体的电子显微镜观察。 （C）AB.衍生的外泌体的质谱分析。 （D）在35hpf斑马鱼胚胎中的ubi：CD63-pHluorin的瞬时镶嵌表达。 （E）通过CD63-pHluorin的瞬时镶嵌表达靶向的尾鳍中的细胞类型的实例。 （F）在成纤维细胞样细胞中观察到的融合实例。
Figure 2: (A)血流中的外泌体注射ubi后的表达CD63-pHluorin的Tg3dpf斑马鱼幼虫的头部中的脉管系统的背视图。 （B）仍然在Sup视频1中显示的延时序列。 （C）ubi血管系统上的EM：CD63-pHluorin pDNA注射的鱼，用针对GFP的金颗粒标记。 （E）如（c）中的EV的囊泡外观的定量。
Figure 3:(A)血流中外泌体的来源和分布在uSL中注射ubi：CD63-pHluorin的3dpf Tg胚胎的荧光图像. （B）用针对GFP的金颗粒标记的YSL中注射ubi：CD63-pHluorin的3dpf Tg胚胎的YSL的EM图像。 （C）放大（c）中所示的区域，显示YSL中的MVE，以及在YSL顶部指向GFP的金颗粒标记阳性的囊泡。 （D）在血液中发现的外泌体大小的EV的EM图像，用针对GFP的金颗粒标记。 （F）YSL衍生的EV中富集蛋白质的质谱分析。 （G）YSL区域中MVB的EM。
Figure 4:分布和靶细胞。（A）在YSL中表达CD63-pHluorin的3dpf Tg胚胎的CVP的Sup Video 5中显示的延时。 （B）Sup Movie 6的15个连续帧的平均投影，显示在YSL中表达CD63-pHluorin的3dpf斑马鱼胚胎中的DA，CVP和CV。 （C）在YSL中表达CD63-pHluorin的6 3dpf Tg斑马鱼胚胎的CVP中CD63-pHluorin信号的热图。 （D）在YSL中表达CD63-pHluorin的3dpf Tg胚胎的CVP。 （E）仍然是Sup，显示在YSL中表达CD63-pHluorin的3dpf Tg的CVP。 （F）在Yp电影中显示的表达CD63-pHluorin的3dpf Tg斑马鱼胚胎中的巨噬细胞的延时，（G）BODIPY-C12注射巨噬细胞倒流在YSL中显示的表达CD63-pHluorin的3dpf斑马鱼胚胎。
Figure 5:YSL-EV与内皮的相互作用和在ISF中的存在。（A）Sup延时，显示在YSL中表达CD63-pHluorin的3dpf斑马鱼胚胎的主要静脉中EV的滚动和停滞。（B）血管壁上CD63-pHluorin囊泡的停留时间的定量。 （C）在YSL中表达CD63-pHluorin的3dpf斑马鱼胚胎的CVP的EM图像。 （D）在YSL中表达CD63-pHluorin的3dpf Tg斑马鱼胚胎的主要静脉的特写。 （E）3dpf Tg斑马鱼胚胎的CVP面积注射CD63-pHluorin pDNA或假注射在YSL中。 （F）普遍存在的RPL5启动子下，在YSL和mCherry中表达CD63-pHluorin的3dpf斑马鱼胚胎的中段主干。
Figure 6: YSL-EV在内皮中的摄取机制。 （A）在YSL，对照处理或用其处理的表达CD63-pHluorin的3dpf Tg斑马鱼胚胎的CVP面积的特写。 （B）如（e）中所进行的实验定量，M1与M2信号的重叠系数。 （C）如在b中，但用180度旋转的绿通道来控制随机重叠。 （D）如a，但仅用于巨噬细胞。 （E）在YSL中表达CD63-pHluorin的3dpf Tg斑马鱼胚胎的CVP区域的特写。 （F）如（b）中进行的实验定量，M1和M2信号的重叠系数。
Figure 7:YSL-EV的功能分析。 （A）Ctrl MO或Syntenin MO处理的1dpf斑马鱼胚胎的透射和荧光图像。 （B）定量Ctrl MO或Syntenin MO处理的1-3dpf斑马鱼胚胎的不同条件。
（C）Ctrl MO或Syntenin MO处理的3dpf斑马鱼胚胎的大小。 （D）在不同处理期间测量的背动脉（DA）中的GFP信号的荧光强度。 （E）在YSL中表达CD63-pHluorin的3dpf Tg斑马鱼胚胎的CVP区域的特写。 （F）在MOctrl或MOSyntA处理的3dpf斑马鱼胚胎中定量M1和M2的重叠系数。 （G）脉管系统尾部高度的定量，从DA到CV或特别是在ISV的CVP测量。
结论
通过对纯化的YSLexosomes的蛋白质组学分析，可以分析它们的组成并揭示它们的性质和它们的生物发生机制的一部分，延伸到体内条件对体外调节外泌体生物发生的分子机制的基础知识。在脉管系统中，将CVP的内皮细胞和巨噬细胞鉴定为靶细胞类型，证实了Hyenne等人在共同提交的研究中的发现。使用该模型，能够通过显示动力蛋白依赖的内吞过程的关键作用来识别靶细胞中外泌体的命运，其涉及内皮细胞中的SR-A。总而言之，数据揭示了模型与研究内源性外泌体和体内EV的起源、组成、生物发生途径、靶标和功能的相关性。
最近的一项研究报道了在转基因大鼠中使用CD63-GFP，尽管该模型充分证明了其对EV转
移至器官和体液的离体分析的有用性，并且与人类相对接近，但其在体内成像的适用性方面受到一定限制。然而，研究仍然受到技术闩锁的限制，该技术闩锁阻碍定量观察非平坦细胞中的荧光爆发。在斑马鱼胚胎的整个生物体中，尤其是体液中，对内源性外泌体进行实时跟踪，开辟了利用该模型高精度地研究体液流动力学的新途径。
值得注意的是，用GW4869处理胚胎不影响YSL的外泌体释放，表明至少对于这种外泌体来源，神经酰胺不是其生物发生的主要调节剂。这些数据表明，在体内，syntenin-AlixESCRT-III途径将优于外泌体生物发生，与吗啉代实验一致，开辟了干扰EV生成和体内功能的新途径。通过细胞类型特异性表达定义荧光外泌体的独特来源，该工具是跟踪外泌体（亚）体从其生产地点到其体内最终目的地的相关报道分子。
虽然之前的研究已经表明肿瘤毒素整合素如何决定其器官形成，但这里介绍的两种模型的组合揭示了外源/病理外泌体和内源/生理外泌体之间的共同摄取机制，这是一种从未有过的有趣表型。在此规模之前进行了探索，循环EV如何在远处靶向特定细胞类型仍有待解决，主要是因为此步骤之前无法捕获，但此处呈现的体内模型开辟了在生理和病理条件下揭示此类机制的新途径。另外，由pDNA注射产生的镶嵌表达将允许随机标记组织内或整个生
物体内的细胞，这取决于与CD63-pHluorin构建体相关的启动子，促进单细胞成像和单EV追踪。因此，文章提出表达外泌体荧光标记物的斑马鱼胚胎作为研究体内内源性EV的新模型，这将揭示解开EV生理学的基本方面并评估其临床应用的新途径。总之，来自Hyenne等人和文章的研究展示了可能在模型生物中研究的各种问题，以验证迄今为止报道的EV的生物学和功能的众多体外研究。
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