V o1.30No.12Dec.2010
折叠麻将桌上海交通大学(医学版) JournalofShanghaiJiaotongUniversity(MedicalScience)?l50l?
文章编号:1674—8115(2010)12—1501—04?论着?
小鼠骨生成诱导因子基因逆转录病毒载体的构建及其在
感应式垃圾桶293T细胞中的表达
郑翠侠.张晓娜，韩兵，宋怀东，马勤耘
(上海交通大学1.医学院附属第九人民医院呼吸病科，上海200011,2.医学院附属瑞金医院分子医学中心上海市内分泌代谢
病研究所，上海200025)
摘要：目的构建小鼠骨生成诱导因子(OIF)基因重组逆转录病毒载体，鉴定其在293T细胞中的表达.方法PCR法扩增
OIF一3FLAG基因，测序后克隆人逆转录病毒载体pMSCVPIG(Puro—IRES—GFP)的相应位点，构建重组逆转录病毒表达载体
pMSCVPIG.OIF.3FLAG，并对重组体进行测序鉴定.应用脂质体分别将PMSCVPIG—OIF一3FLAG和VSVG,GAG—POL辅助病毒包
装载体共转染至293T包装细胞,48h后荧光显微镜下观察绿荧光
蛋白(GFP)表达；收集包装细胞上清液，进一步用含有包装
病毒的上清液再感染293T细胞,48h后加入3Ixg/mL嘌呤霉素(puromycin)，连续7d，筛选病毒感染的稳定表达pMSCV PIG—OIF.3FLAG的293T细胞株，分别采用Real—timePCR技术和Westernblotting方法检测293T细胞OIFmRNA及其蛋白表达.
结果构建OIF基因逆转录病毒表达载体PMSCVPIG—OIF一3FLAG，经酶切及测序鉴定证实目的基因插入位点和读码框架正确;
病毒感染293T细胞，经嘌呤霉素筛选稳定表达小鼠OIF的293T细胞株;Real—timePCR和Westernblotting鉴定证实OIFmRNA
和蛋白在该细胞株中呈高表达.结论成功构建小鼠OIF基因的逆转录病毒载体，并获得稳定高表达OIF基困的293T细胞株.
关键词：逆转录病毒载体；小鼠骨生成诱导因子;293T细胞
D0I:10.3969/j.issn.1674—8l15.2010.12.013中图分类号:Q78文献标志码:A Constructionofmouseosteoinductivefactorgeneretroviralvectorandits expressionin293Tcells
ZHENGCui.xia,ZHANGXiao.na,HANBing,SONGHuai—dong,MAQin —yun汽车脚垫制造设备
r.DepartmentofRespiratoryMedicine,TheNinthPeople’sHospital,Shangh aiJiaotongUniversitySchoolofMedicine,
Shanghai200011,China;2.MolecularMedicineCenter,ShanghaiInstituteo fEndocrinology,RuijinHospital,Shanghai
JiaotongUniversitySchoolofMedicine,Shanghai200025,China) Abstract:ObjectiveToconstructmouseosteoinductivefactor(OIF)generec ombinantretroviralvector,andinvestigateits
锌合金压铸工艺expressionin293Tcells.MethodsOIF一3FLAGgenewasamplifiedwithPCRandclonedintoretroviralvector(Puro—IRES—GFP)aftersequencing,andrecombinantretroviralvectorpMSCVPI G—OIF一3FLAGwasconstructedandidentifiedby
sequencing.PMSCVPIG—OIF一3FLAGretroviralvectorwithhelpervectorsofVSAGandGAG—POLwereco —transfectedinto
293Tcellsbylipofeetamine2000.Forty—eighthoursaftertransfection,thee xpressionofgreenfluorescentprotein(GFP)was examinedbyfluorescencemicroscopy.Thesupernatantof293Tcells,which weretansfectedwithpMSCVPIG-OIF一3FLAG retroviralvectorandhelpervectorsofVSAGandGAG—POL,wasusedtorei nfect293Tcells.After48h,293Tcellsstably expressingpMSCVPIG—OIF一3FLAGretroviralvectorwerescreenedby3p~g/mLpuromycinfor7d.andthee xpressionof
OIFmRNAandproteinof293TcellswasdetectedbyReal—TimePCRandW esternblotting,respectively.ResultsOIF generetroviralvectorpMSCVPIG—OIF一
3FLAGwassuccessfullyconstructed,andthecloningsiteandreadingframeof objectivegenewereconfirme
dbyenzymedigestionandsequencing.Then,29 3Tcellswereinfectedbyretrovirus
supernatant,and293TcellswithstableexpressionofmouseOIFwereobtaine dbypuromycinscreening.Real—TimePCRand WesternblottingrevealedhighexpressionofOIFmRNAandproteinin293Tc ells.ConclusionMouseOIFgene retroviralvectorhasbeensuccessfullyconstructed,and293Tcellswithstable expressionofOIFgeneareobtained.
Keywords:retroviralvector;mouseosteoinductivefactor;293Tcell 基金项目：上海市自然科学基金(IOZR1418300)(ShanghaiNaturalScienceFoundation,10ZR1418300).
作者简介：郑翠侠(1966一)，主任医师，博士生；:***************.
通讯作者：马勤耘，:********************.
开关柜测温装置上海交通大学(医学版)
骨生成诱导因子(osteoinductivefactor,OIF)又
称为mimecan,osteoglycin，属亮氨酸富集蛋白家族,
是一种分泌蛋白.在不同的物种之间，该基因的结
构高度保守，提示OIF蛋白在生物体内可能具有重
要的功能.Northern分析发现,OIF在牛的巩膜，角
膜中高表达¨，最近蛋白质组学研究发现,OIF在
人的眼角膜，牙齿基质中表达；兔动脉血管外
膜mimecan表达下调与动脉正常发育相关.本
课题组前期的Northern分析结果发现:OIF在垂体
和肾上腺组织中均有表达，其在垂体中的表达受垂
体特异性转录因子(pituitaryspecifictranscription factor1,Pit-1)和糖皮质激素调控，提示OIF可能在
下丘脑一垂体一肾上腺轴生理功能的调节中发挥重要作用.
本研究通过体外构建OIF基因逆转录病毒表达
载体，并筛选出稳定表达OIF的293T细胞，旨在为
深入研究OIF的功能及机制奠定基础.
1材料与方法
1.1主要试剂
车载卫生间pMSCVPIG(Clontech)；大肠杆菌DH5ct,Taq酶
(天根公司)；限制性内切酶BglII和XhoI,Real—Time试剂盒(TaKaRa);T连接酶，割胶纯化试剂盒
和Oligo(dT)15Primer(Promega)；质粒小抽提试剂盒(Axygen)；中抽试剂盒(MN);293T人胚肾细胞株
(下文中简称293T细胞)(A TCC)；脂质体Lipo- fectamine2000,TRIzol和逆转录酶SuperScriptlI ReverseTranscriptase(Invitrogen)；细胞培养基DMEM，感染带有OIF基因的逆转录病毒的药物嘌呤
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