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全长cDNA酶切和连接体系

用测序时所构建的各片段重组质粒作模板，用新合成的加有连接酶切位点的引物扩增出需要连接的各片段。LF1在扩增时，由于片段比较长，故分为两步进行扩增，第一步扩增后，连接到pMD-18T载体上，再用此作模板进行第二次扩增。得到所需的加有酶切位点和启动子序列的目的片段，再将其克隆到pMD-18T载体上。使用时每次从载体上切取目的片段进行连接。

F5、F6和F7片段的连接，F5(Not I/ Fsp I)、F6(Fsp I/Csp45 I)、F7(Csp45 I/Sal I)分别进行酶切，将载体pGEM5zf同时进行Not I/Sal I双酶切，分别将各酶切产物进行纯化回收。由于F5片段和载体pMD18-T大小相近，故无法回收酶切后的目的片段，所以F5片段直接采用PCR产物进行双酶切。各片段的酶切体系如下：

灭菌去离子水	4.3µl
10×buffer	2µl
BSA	0.3µl
DNA	12µl
酶1	0.7µl
dmm1酶2	0.7µl
37℃，酶切3h，回收各酶片段。20µl酶切体系

酶切buffer F5用buffer D、F6用buffer B、F7用 buffer D

F21和F22的连接，将F21和F22 PCR测序片段分别用Nhe I酶切后，回收目的条带，将二者用T4 DNA酶连接后，克隆到T-easy载体上。即为连接全长所用的F2片段。连接时，直接用设计时的两端酶切位点。

LF3和LF4同样用Acc III酶切后，用T4 DNA连接酶连接，再克隆到pMD-18T载体上，用于5’半长的连接。

F21、F22连接酶切体系：

Nhe I 1µl；10×M buffer 2µl；DNA 17µl；

F3、F4连接酶切体系：

Acc III 1µl；10×F buffer 2µl；BSA 0.2µl；DNA 16.8µl。

37℃ 3h酶切。纯化回收时，注意各种限制性酶的灭活(65℃,10min)。

连接体系：

T4 DNA连接酶buffer 2µl；T-easy(F2) or pMD-18T(F34) 2µl；回收DNA片段15µl；T4 DNA连接酶 1µl。16℃ 6h，再4℃过夜。转化感受态JM109。

5’半长cDNA酶切体系：

	pGEM-5zf(+)			F1片段		F2片段		F34片段
体系	40µl体系			30µl体系		40µl体系		40µl体系
灭菌水	2.4			4.0		2.4		2.4
10×buffer	Buffer D		4	Buffer D	3拉丝模	Buffer D	4	Buffer D	4
BSA	0.6			0.6		0.6		0.6
DNA	30			20		30		30
酶1	Not I	1.5		Not I	1.2	Pvu I	1.5	Nsi I	1.5
酶2	Sal I	1.5		Pvu I	1.2	Nsi I	1.5	Sal I	1.5

5’半长连接体系

	20µl	10µl
T4 DNA ligase	1.1	0.5
10×buffer	2	1
F1	5.3	2.7
F2	5.3	2.7
F34	5.3	2.7
pGEM-5zf(+)	1	0.4
16℃，过夜，次日4℃保存至闪日下午转化。

全长连接时的5’半长与3’半长酶切体系

温泉浴片麦饭石杯

40µl体系	5’-half 陈皮酱		3’-half
10×D buffer	4		4
灭菌水	2.4		2.4
BSA	0.6		0.6
DNA	30		30
酶1	Not I	1.5	Spl I	1.5
酶2	Spl I	1.5	Sal I	1.5
37℃ 3h。
	远距离遥控器