一种土霉素菌种的初筛选育方法与流程

1.本发明属于生物制药领域，涉及一种土霉素菌种的初筛选育方法。

背景技术：

2.土霉素又称地霉素、氧四环素，是一种四环类抗生素，主要用于饲料添加剂，可改善饲料转化效率，促进畜禽生长，提高畜禽抗疾病能力，土霉素对革兰氏阳性菌(如：肺炎球菌、溶血性链球菌及部分葡萄糖球菌、杆菌)、革兰氏阴性菌(如：大肠杆菌、产气杆菌、肺炎杆菌)、螺旋体、沙眼衣原体、放线菌、克次氏体等均具有抗菌作用，所以土霉素主要用于肺炎、败血症、斑疹、伤寒、淋巴肉芽肿、沙眼及其他细菌性感染。
3.目前，全世界的医药产品生产已有一半以上由生物技术合成，其中抗生素、维生素、激素这三大类主要由微生物发酵生产，抗生素在世界范围内的应用十分广泛，从而有效地控制了许多传染疾病，同时也促进了发酵工业的发展，土霉素生产工艺简单，生产成本较低，可作为生产其它新型抗生素的原料，市场容量越来越大，销售前景较为乐观。随着土霉素研究的深入，提高发酵水平，提高菌种的产土霉素能力，增加无成本的经济效益，势在必行，因此，有必要寻和改进菌种选育的方法。
4.土霉素的产生菌为龟裂链霉菌属放线菌，一般以孢子的形式保存。由于该菌种选育程序要经过分离、初筛、复筛、稳定性试验，选育时间较长，一般在3-6个月，进行一次菌种选育挑选菌落一般在50-500个左右，进行摇瓶试验的工作量较大，周期较长。
5.目前，国内土霉素菌种的选育在初筛阶段一般采取二级发酵模式，即将分离好的菌落接入斜面，将生长好的斜面孢子接入种子摇瓶后，培养22-26小时，取生长好的种子液接种发酵瓶，培养5天后放瓶，测定效价。由于初筛种子瓶和发酵瓶是一对一转接，挑选的菌落越多，需要的摇瓶也越多，工作量就越大，占用的摇床也就越多，摇床的利用率有限。
6.因此，亟需到一种可行的土霉素菌种的初筛选育方法。

技术实现要素：

7.本发明的目的在于提供一种土霉素菌种的初筛选育方法，本发明能有效提高选育效果，可有效提高选育频率，降低选育周期和成本，实现土霉素菌种的高效选育。
8.本发明提供了一种土霉素菌种的初筛选育方法，包括如下步骤：
9.1)培养基的配制及灭菌
10.所述培养基包括如下质量体积浓度的组分制成：质量体积浓度单位以kg/m3计，溶剂为水，
11.玉米淀粉100～160；黄豆饼粉20～60；酵母粉1～4；碳酸钙10～16；硫酸铵10～17；氯化钠1～8；玉米浆4～10；磷酸二氢钾0.1～0.5；固体消泡剂0.1～0.5；硫酸锌0.1～0.5；淀粉酶0.1～0.5；
12.将所述玉米淀粉、黄豆饼粉、酵母粉及玉米浆加水调成糊状物，然后加入到沸水中，搅拌，然后加入硫酸铵、氯化钠、磷酸二氢钾、硫酸锌和固体消泡剂及淀粉酶，再加入碳
酸钙搅拌加水定容至所配制的体积，分装后灭菌，得到灭菌后的培养基；
13.2)接种方法
14.将所述灭菌后的培养基的斜面挖块进行恒温培养，发酵结束后发酵液为暗褐粘稠液体，菌丝分节短、细、染浅，效价在14000u/ml以上，即实现土霉素菌种的初筛选育。
15.本发明中，所述溶剂具体可采用自来水。
16.上述的方法中，步骤1)中所述分装的操作如下：分装到40ml～250ml的三角瓶中，加8层纱布及牛皮纸包扎；
17.所述灭菌的条件如下：在高压消毒锅中119～121℃、0.090～0.105mpa灭菌30分钟。
18.上述的方法中，所述挖块的面积可为1～1.5cm2，具体可为1cm2；
19.所述培养的条件：旋转摇瓶机的转速可为240转/分，31.5
±
1.5℃恒温培养7天。
20.上述的方法中，所述培养基包括如下质量体积浓度的组分制成：单位为kg/m3，溶剂为水；
21.玉米淀粉100；黄豆饼粉20；酵母粉3；碳酸钙14；硫酸铵12；氯化钠7；玉米浆7；磷酸二氢钾0.2；固体消泡剂0.2；硫酸锌0.1；淀粉酶0.2。
22.上述的方法中，所述培养基包括如下质量体积浓度的组分制成：单位为kg/m3，溶剂为水；
23.玉米淀粉110；黄豆饼粉30；酵母粉4；碳酸钙13；硫酸铵14；氯化钠5；玉米浆6；磷酸二氢钾0.15；固体消泡剂0.1；硫酸锌0.2；淀粉酶0.15。
24.本发明还提供了一种培养基，所述培养基包括如下质量体积浓度的组分制成：单位为kg/m3，溶剂为水；
25.玉米淀粉100～160；黄豆饼粉20～60；酵母粉1～4；碳酸钙10～16；硫酸铵10～17；氯化钠1～8；玉米浆4～10；磷酸二氢钾0.1～0.5；固体消泡剂0.1～0.5；硫酸锌0.1～0.5；淀粉酶0.1～0.5。
26.上述的培养基中，所述培养基包括如下质量体积浓度的组分制成：单位为kg/m3，溶剂为水；
27.玉米淀粉100；黄豆饼粉20；酵母粉3；碳酸钙14；硫酸铵12；氯化钠7；玉米浆7；磷酸二氢钾0.2；固体消泡剂0.2；硫酸锌0.1；淀粉酶0.2。
28.上述的培养基中，所述培养基包括如下质量体积浓度的组分制成：单位为kg/m3，溶剂为水；
29.玉米淀粉110；黄豆饼粉30；酵母粉4；碳酸钙13；硫酸铵14；氯化钠5；玉米浆6；磷酸二氢钾0.15；固体消泡剂0.1；硫酸锌0.2；淀粉酶0.15。
30.本发明所述的培养基应用于土霉素菌种的初筛选育中。
31.本发明具有如下优点：
32.本发明采用改良配方的培养基培养，将现有技术中一直延续使用的初筛的2个步骤种子瓶转接发酵瓶合并为一个步骤，并且在不影响土霉素摇瓶的发酵单位的前提下，不需经转接发酵瓶，从而减少一半的工作量，减少染菌机率，增加选育菌株的数量，提高摇床的使用效率，从而增加菌种选育的效率。
具体实施方式
33.下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
34.下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
35.为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面对本发明的优选育实施例进行详细的描述。
36.本发明提供了一种土霉素菌种的初筛选育方法，包括如下步骤：
37.(1)摇瓶培养基的制备、灭菌
38.摇瓶培养基的组成和含量如下表1所示，溶剂为自来水。
39.表1 摇瓶培养基的配方(kg/m3)
[0040][0041][0042]
配制及灭菌：将按照配比称好的玉米淀粉、黄豆饼粉、酵母粉及玉米浆加适量水调成糊状物，然后加入到沸水中，搅拌均匀，然后加入硫酸铵等无机盐和固体消泡剂及淀粉酶，再加入碳酸钙搅拌均匀加水定容至所配制的体积，分装40ml到250ml的三角瓶中，加8层纱布及牛皮纸包扎，在高压消毒锅中119-121℃、0.090-0.105mpa灭菌30分钟。
[0043]
(2)接种方法：在培养好的斜面挖块1～1.5cm2在220～260转/分旋转摇瓶机31.5
±
1.5℃恒温培养5～7天，发酵结束后发酵液为暗褐粘稠液体，菌丝分节短、细、染浅，效价在14000u/ml以上。
[0044]
实施例1
[0045]
(1)培养基的配制和灭菌
[0046]
摇瓶培养基的组成和含量具体如下表2所示，溶剂为自来水。
[0047]
表2 摇瓶培养基的配方1(kg/m3)
[0048]
原料名称含量玉米淀粉100
黄豆饼粉20酵母粉3碳酸钙14硫酸铵12氯化钠7玉米浆7磷酸二氢钾0.2固体消泡剂0.2硫酸锌0.1淀粉酶0.2
[0049]
配制及灭菌：将按照配比称好的玉米淀粉、黄豆饼粉、酵母粉及玉米浆加适量水调成糊状物，然后加入到沸水中，搅拌均匀，然后加入硫酸铵等无机盐和固体消泡剂及淀粉酶，再加入碳酸钙搅拌均匀加水定容至所配制的体积，分装40ml到250ml的三角瓶中，加8层纱布及牛皮纸包扎，在高压消毒锅中119-121℃、0.090-0.105mpa灭菌30分钟。
[0050]
(2)接种方法：在培养好的斜面挖块1～1.5cm2在240转/分旋转摇瓶机31.5
±
1.5℃恒温培养7天，发酵结束后发酵液为暗褐粘稠液体，菌丝分节短、细、染浅，效价在14000u/ml以上。
[0051]
实施例2
[0052]
(1)培养基的配制和灭菌
[0053]
摇瓶培养基的组成和含量具体如下表3所示，溶剂为自来水。
[0054]
表3 摇瓶培养基的配方2(kg/m3)
[0055]
原料名称含量玉米淀粉110黄豆饼粉30酵母粉4碳酸钙13硫酸铵14氯化钠5玉米浆6磷酸二氢钾0.15固体消泡剂0.1硫酸锌0.2淀粉酶0.15
[0056]
配制及灭菌：将按照配比称好的玉米淀粉、黄豆饼粉、酵母粉及玉米浆加
[0057]
适量水调成糊状物，然后加入到沸水中，搅拌均匀，然后加入硫酸铵等无机盐和固体消泡剂及淀粉酶，再加入碳酸钙搅拌均匀加水定容至所配制的体积，分装40ml到250ml的三角瓶中，加8层纱布及牛皮纸包扎，在高压消毒锅中119-121℃、0.090-0.105mpa灭菌30分钟。
[0058]
(2)接种方法：在培养好的斜面挖块1～1.5cm2在240转/分旋转摇瓶机31.5
±
1.5
℃恒温培养7天，发酵结束后发酵液为暗褐粘稠液体，菌丝分节短、细、染浅，效价在14000u/ml以上。
[0059]
对比例、
[0060]
初筛就是初步筛选，以多量筛选为原则。将分离培养好的单菌落接到30
×
200mm试管斜面中，35.5
±
1.5℃培养65～72小时，再在29
±
1.5℃下恒温培养20～24小时，然后将生长好的斜面直接接入种子瓶，在31.5
±
1.5℃培养20～26小时，然后转入发酵瓶，31.5
±
1.5℃培养7天，测定其效价，初筛时以出发菌株做对照，高单位菌株的挑选一般要比对照菌株效价提高10％左右，挑选量以5～20％为宜。
[0061]
1、种子摇瓶培养基的制备、灭菌及接种方法
[0062]
表4 种子培养基的制备(kg/m3)
[0063]
原料名称含量玉米淀粉10-50黄豆饼粉1-5酵母粉1-4碳酸钙2-6硫酸铵2-7氯化钠1-6玉米浆1-9磷酸二氢钾0.1-0.5
[0064]
1)配制及灭菌：将按照表4中配比称好的玉米淀粉、黄豆饼粉、酵母粉及玉米浆加适量水调成糊状物，然后加入到沸水中，搅拌均匀，然后加入硫酸铵和氯化钠无机盐，再加入碳酸钙搅拌均匀加水定容至所配制的体积，分装30ml到250ml的三角瓶中，加4克棉塞2层纱布及牛皮纸包扎，在高压消毒锅中119-121℃、0.090-0.105mpa灭菌30分钟。
[0065]
2)接种方法：在培养好的斜面挖块1～1.5cm2在240转/分旋转摇瓶机31.5
±
1.5℃恒温培养26小时，培养好的种子液为浅黄粘稠液体，ph为6.6-7.1镜检菌丝生长良好，菌丝密网状分节、菌丝粗壮，无杂菌。
[0066]
2、发酵摇瓶培养基的制备、灭菌及接种方法
[0067]
表5 发酵培养基的制备(kg/m3)
[0068]
[0069][0070]
1)配制及灭菌：将按照表5中配比称好的玉米淀粉、黄豆饼粉、酵母粉及玉米浆加适量水调成糊状物，然后加入到沸水中，搅拌均匀，然后加入硫酸铵等无机盐和固体消泡剂及淀粉酶，再加入碳酸钙搅拌均匀加水定容至所配制的体积，分装40ml到250ml的三角瓶中，加8层纱布及牛皮纸包扎，在高压消毒锅中119-121℃、0.090-0.105mpa灭菌30分钟。
[0071]
2)接种方法：将培养好的种子液按照10％的接种量接入发酵瓶，在240rpm旋转摇瓶机31.5
±
1.5℃恒温培养7天，发酵结束后发酵液为暗褐粘稠液体，菌丝分节短、细、染浅，效价在14000u/ml以上。
[0072]
通过上述实施例1-2与对比例中数据结果可知，对比例中初筛需要2个步骤种子瓶转接发酵瓶，而本发明实施例采用新的培养基培养仅需一个步骤即可实现，并且在不影响土霉素摇瓶的发酵单位的前提下，不需经转接发酵瓶，从而减少一半的工作量，减少染菌机率，增加选育菌株的数量，提高摇床的使用效率，从而增加菌种选育的效率。
[0073]
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。

技术特征：

1.一种土霉素菌种的初筛选育方法，包括如下步骤：1)培养基的配制及灭菌所述培养基包括如下质量体积浓度的组分制成：单位为kg/m3，溶剂为水；玉米淀粉100～160；黄豆饼粉20～60；酵母粉1～4；碳酸钙10～16；硫酸铵10～17；氯化钠1～8；玉米浆4～10；磷酸二氢钾0.1～0.5；固体消泡剂0.1～0.5；硫酸锌0.1～0.5；淀粉酶0.1～0.5；将所述玉米淀粉、黄豆饼粉、酵母粉及玉米浆加水调成糊状物，然后加入到沸水中，搅拌，然后加入硫酸铵、氯化钠、磷酸二氢钾、硫酸锌和固体消泡剂及淀粉酶，再加入碳酸钙搅拌加水定容至所配制的体积，分装后灭菌，得到灭菌后的培养基；2)接种方法将所述灭菌后的培养基的斜面挖块进行恒温培养，发酵结束后发酵液为暗褐粘稠液体，菌丝分节短、细、染浅，效价在14000u/ml以上，即实现土霉素菌种的初筛选育。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中所述分装的操作如下：分装到40ml～250ml的三角瓶中，加8层纱布及牛皮纸包扎；所述灭菌的条件如下：在高压消毒锅中119～121℃、0.090～0.105mpa灭菌30分钟。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述挖块的面积为1～1.5cm2；所述培养的条件：旋转摇瓶机的转速为240转/分，31.5
±
1.5℃恒温培养7天。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述培养基由如下质量体积浓度的组分制成：单位为kg/m3，溶剂为水；玉米淀粉100；黄豆饼粉20；酵母粉3；碳酸钙14；硫酸铵12；氯化钠7；玉米浆7；磷酸二氢钾0.2；固体消泡剂0.2；硫酸锌0.1；淀粉酶0.2。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述培养基包括如下质量体积浓度的组分制成：单位为kg/m3，溶剂为水；玉米淀粉110；黄豆饼粉30；酵母粉4；碳酸钙13；硫酸铵14；氯化钠5；玉米浆6；磷酸二氢钾0.15；固体消泡剂0.1；硫酸锌0.2；淀粉酶0.15。6.一种培养基，其特征在于，所述培养基包括如下质量体积浓度的组分制成：单位为kg/m3，溶剂为水；玉米淀粉100～160；黄豆饼粉20～60；酵母粉1～4；碳酸钙10～16；硫酸铵10～17；氯化钠1～8；玉米浆4～10；磷酸二氢钾0.1～0.5；固体消泡剂0.1～0.5；硫酸锌0.1～0.5；淀粉酶0.1～0.5。7.根据权利要求6所述的培养基，其特征在于，所述培养基包括如下质量体积浓度的组分制成：单位为kg/m3，溶剂为水；玉米淀粉100；黄豆饼粉20；酵母粉3；碳酸钙14；硫酸铵12；氯化钠7；玉米浆7；磷酸二氢钾0.2；固体消泡剂0.2；硫酸锌0.1；淀粉酶0.2。8.根据权利要求6所述的培养基，其特征在于，所述培养基包括如下质量体积浓度的组分制成：单位为kg/m3，溶剂为水；玉米淀粉110；黄豆饼粉30；酵母粉4；碳酸钙13；硫酸铵14；氯化钠5；玉米浆6；磷酸二氢钾0.15；固体消泡剂0.1；硫酸锌0.2；淀粉酶0.15。9.权利要求6-8中任一项所述的培养基在土霉素菌种的初筛选育中的应用。

技术总结

本发明公开了一种土霉素菌种的初筛选育方法。本发明土霉素菌种的初筛选育方法，包括如下步骤：1)培养基的配制及灭菌：将玉米淀粉、黄豆饼粉、酵母粉及玉米浆加水调成糊状物，然后加入到沸水中，搅拌，然后加入硫酸铵、氯化钠、磷酸二氢钾、硫酸锌和固体消泡剂及淀粉酶，再加入碳酸钙搅拌加水定容至所配制的体积，分装后灭菌，得到灭菌后的培养基；2)接种方法：将灭菌后的培养基的斜面挖块进行恒温培养，发酵结束后发酵液为暗褐粘稠液体，菌丝分节短、细、染浅，效价在14000u/ml以上，即实现土霉素菌种的初筛选育。本发明能有效提高选育效果，可有效提高选育频率，降低选育周期和成本，实现土霉素菌种的高效选育。实现土霉素菌种的高效选育。