刘彦明 刘二保 程介克3
水性阻燃剂(武汉大学化学系，武汉430072)
摘 要 科学的进步不但要求对物质的整体特征进行鉴定和测定，同时还要求对单分子化学和物理性质进行深入探索。在单分子水平对物质进行研究，是一项重要的学科前沿交叉领域，对分子工程学、分子生物学、分子医学、纳米材料和信息科学具有非常重要的意义。本文评述近年来溶液中单分子检测研究的最新进展，包括激光诱导荧光检测、电化学检测及我们最近提出的化学发光检测等。并对这一学科前沿领域进行了展望。 关键词 单分子检测，激光诱导荧光，电化学，化学发光，评述
2001207206收稿;2001212207接受
本文系国家自然科学基金资助项目(N o.20075017)
1 前 言
单分子检测(single m olecules detection ,S M D )是分析化学家长期以来梦寐以求的一项富有挑战性的前沿领域，达到了分子检测灵敏度的极限，是物质低含量监测技术中最后一个里程碑1。S M D 为分析化学开辟了一个新的领域，也为分子世界打开了一个崭新的景象，已取得了惊人的进展。S M D 能检测非均匀聚集体中的单个分子，并对它们进行识别、分类和定量描述，也可对化学反应的途径进行实时监测，特别是能在生理条件下对生物大分子进行探测并提供分子结构和功能之间的信息。而这些用传统的检测方法是非常困难、甚至无法获得的。S M D 快速、卓越的进展无疑将影响许多科学领域2，为在化学、生物学、医学和纳米材料等前沿领域中探索，提供了新的手段。许多国家已竞相将此列为面向21世纪的、具有挑战性的、战略性基础研究的优先领域。最近，中国国家自然科学基金委员会已将单分子和单原子检测技术列为“十五”期间分析化学学科基础研究优先资助的领域3。
燕窝 亚硝酸盐分析化学家对检测溶液中单分子最感兴趣。溶液中单分子检测从检测原理已报道有激光诱导荧光和电化学两种方法，前者应用较为普遍。美国洛斯阿拉莫斯(Los Alam os )国家实验室的Castro 4、K eller 5及G oodwin 等6在单分子光学检测方面做了一系列工作；最近对室温下7、凝聚态物质8中单分子检测及其在生物化学分析2方面的应用均有评述。Bard 等9综述了单分子电化学检测。本文评述近年来检测溶液中单分子的最新进展，并对该前沿领域的前景进行了展望。
2 激光诱导荧光检测
在单分子光学检测法中，激光诱导荧光(laser 2induced fluorescence ,LIF )以其灵敏度高的特点成为目前应用最广泛的检测手段。本文着重评述这方面的工作。LIF 的基本原理是：在激光照射下，荧光分子
从基态到激发态，发射光子回到基态。如此反复循环，产生大量光子，即所谓的“光子爆发”
(photon burst )。根据荧光寿命和分子在激光束中停留时间，可算出单个分子发射的最大光子数为105～106。目前光学检测系统收集、检测光子的效率约为1%5或0.5%～5%10，故单个分子仍可被检测到数千光子信号。由于光学和溶剂噪音限制，目前LIF 的检出限约为10-13m ol/L 。
Hirsch feld 11于1976年用80～100个荧光素异硫氰酸盐分子标记到单个抗体上，首次观察了单个生物分子。随后对单分子检测进行了一系列研究，检测分子数不断得到改善12～19。1990年,Shera 等17首次实现了溶液中单个罗丹明6G (R6G )分子的检测。后来,S oper 等20又成功检测了单个IR132染料分子。
在单分子检测中，单分子的识别是一个重要问题，尤其对混合溶液。目前主要基于荧光分子的光物第30卷
2002年8月 分析化学(FE NXI H UAX UE ) 评述与进展Chinese Journal of Analytical Chemistry 第8期1000～1004
理性质差异来进行，有以下几种方法:
①光谱法 S oper 等21首次利用发射光谱的差异，对溶液中的R6G 和得克萨斯红进行了识别。②荧光寿命法 最近,Sauer 等22,23利用荧光寿命分别辨认了人血清中标记不同的抗原分子、荧光
标记的3种单核苷酸等摩尔混合物中的Cy52dCTP (τf =1.05±0.33ns ),MR1212dUTP (τf =2.07±
0.59ns )和Bodipy 2dUTP (τf =3.88±
1.71ns )分子。③光子爆发量(强度)(photon burst size ) 分子不同，荧光量子产率等光物理性质不同，导致发射的光子数(光子爆发量)不同。基于此,Van Orden 等24首次识别了流动样品流中R6G 和TRITC 分子。采用M onte Carlo 模拟给出了单分子检测效率、分子识别置信水平及误差来源。此法适宜于光谱性质相似分子的识别，且具只需单激发光源和单检测通道简易装置的特点。
④时间分辨荧光各向异性(time 2res olved fluorescence anis otropy ) 与分子的旋转驰豫时间有关，可用于溶液中自由扩散单分子的识别。如若丹明123和荧光黄蛋白分子的光物理性质相似，但旋转驰豫时间相差2个数量级。据此,Schaffer 等25识别了溶液中两组分分子。
LIF 检测单分子的关键在于降低由瑞利散射、拉曼散射及溶剂杂质荧光产生的背景干扰。由于单分子信号与探测体积无关，而背景正比于探测体积，所以采用pL 级或更小的探测体积，再结合光谱滤波和
时间分辨等技术，始能实现单分子检测，有以下几种途径。
2.1 流体聚焦法
检测溶液中单分子，该法扮演了主要角。它采用了流式细胞仪的方法26，将样品引入微流动池中，经聚焦激光束照射，在灵敏检测器上成像。检测器为光电倍增管或单光子计数雪崩光电二极管(S APD ),S APD 在可见光中区有较高的检测效率27。该法的优点是聚焦的样品流远离池壁，降低了散射光、电解质对池壁的吸附作用和脱附的杂质分子进入检测体积(1～10pL )的几率。
Dovichi 等14首先使用流体聚焦法引入样品、LIF 检测。使用脉冲激光作光源及时间门控技术，检测了单个R6G 分子17。脉冲激发和门控技术的使用，可有效降低瑞利和拉曼散射，获得优良的信噪比，并已应用于测量单个R101分子的寿命28。张亮等29也探测了单个C445荧光染料分子。
溶剂中杂质荧光背景可显著降低信噪比。在样品被引入微流动池之前，采用光漂白的方法，可将杂质背景至少降低1个数量级30。
2.2 微滴法
利用pL 级微滴检测溶液中单分子具有溶剂背景低、激光照射时间长、信号强度大等特点。Barnes 小组进行了一系列研究，实时观测了微滴流中单个R6G 分子的荧光31～33。尤其是检测超稀溶液中R6
G 单分子时，检出限达到了10-15m ol/L 34。这是目前微滴法检测溶液中单分子最低的检出限。微滴法的主要不足在于样品分析速度较慢。
2.3 共聚焦显微法
该法探测体积很小，通常为fL 至亚fL ，因此背景可忽略不计，具有很高的信噪比。但由于布朗运动导致分子进入探测区域的概率较小，因而分子检测效率很低。
Rigler 小组35率先开展共聚焦显微法检测溶液中单分子的研究。Nie 等18,36利用该法实现了对单个荧光素和高氯酸罗丹明6G 分子的实时检测，并进一步应用于荧光标记的脱氧核酸、双链DNA 的单个生物分子研究。Prummer 等37首次报道使用光谱和时间分辨荧光检测、鉴定了4种染料单分子(R6G 、SrB 、DBATT 和DiI )，而共聚焦探测体积仅为100aL 。最近，共聚焦显微法检测单分子的一个有趣应用是可对单个染料分子与DNA 链上鸟嘌呤相互作用的动力学进行观测。Rigler 等38研究发现，用四甲基罗丹明标记到DNA 低聚物上，二者相互作用后存在两种构象。Eggeling 等39研究了同一体系后，观测到3种构象，并通过它们的荧光寿命和光子爆发量进行了证实。
2.4 微毛细管和微芯片法
使用微毛细管和微芯片也可开展单分子检测研究。近年来，该法应用有渐热趋势，特别是在生物单分
子研究方面。此法毛细管内径狭小并全部被辐照，分子通过狭窄探测窗口，可获得较高的检测效率。G uenard 等40利用双通道实现了IR140单分子的连续检测，测量效率近于1。在毛细管法检测单分子
1001第8期刘彦明等：检测溶液中单分子
2001 分析化学第30卷
中，样品溶液的引入量必须准确控制。为此，毛细管头部常被制成锥形19,41。使用芯片毛细管电泳分离及检测单个染料分子也有报道42。
近年来，利用毛细管电泳在分子水平上研究酶或蛋白分子的行为，揭示它们是否存在不同的构象，引起了人们的极大兴趣。Y eung等43应用毛细管电泳分离LIF检测，对单个乳酸脱氢酶分子的活性进行了研究。结果表明酶分子的活性存在差异，并认为这种差异缘于酶分子构象的不同。Dovichi等44详细研究了单个碱性磷酸酶分子的催化行为，得出了相同的结论。最近对纯化过的细菌碱性磷酸酶分子的研究，发现纯化的酶分子有相同的活性，并认为这缘于分子的结构决定分子的功能所致45。
3 电化学检测
用电化学手段研究单个分子是近年来提出的一种新的检测技术，它可以确定半反应电势、自由能及反应动力学。溶液中分子在两个电极间进行反复循环氧化还原反应，形成回路和可测量的电流，据此可
进行S M D46,47。Fan和Bard46使用扫描电化学显微镜调整超微电极(15nm)和导电底物IT O之间的距离为10nm，形成一个内含单个CP2FeT M A+分子的微小溶液体积，研究了单分子CP2FeT M A+到CP2FeT M A2+的氧化作用。在某些特殊场合下，通过电极上的电致化学发光也可进行S M D48。Xu和Bard49首次将DNA吸附到合适的结构表面上，嵌入Ru(phen)2+3，在三丙胺存在下,Ru(phen)2+3被氧化产生电致化学发光，从而对DNA进行检测，这为DNA等生物单分子的检测提供了一个新的途径。
4 化学发光检测
目前单分子检测的对象均为有机荧光染料分子或由其标记的生物分子。无机分子(离子)的单分子检测尚未见报道8。T an和Y ueng50使用激光光学显微镜和CC D检测系统，监测了单个Os(Ⅷ)催化Ce (Ⅳ)与As(Ⅲ)之间的氧化还原反应，检测了反应产物Ce(Ⅲ)的荧光。这表明应用适当的催化荧光反应有可能检测单个金属离子。
化学发光具有很高灵敏度，且无需外加光源、仪器装置简单，不存在荧光分析中光学系统因瑞利散射和拉曼散射及溶剂荧光杂质产生的背景噪音，具有信噪比高的特点。但化学发光选择性差、干扰严重。毛细管电泳在线化学发光检测，则能发挥高灵敏度和高选择性的特。最近，我们研究组发现V (Ⅳ)对鲁米诺和过氧化氢的化学发光反应具有显著的催化作用。利用我们改进的毛细管电泳2化学发光检测装置51和新的试剂混合模式52，对VΕ的检测达到了单分子水平。这一研究为单分子检测开拓了一个新的方法。
5 展 望
综上所述，溶液中单分子检测涉及到化学、生物、医学、材料等多个学科领域，对其进行研究具有十分重要的意义。近年来人们做了一些系统性的工作,2000年已出现“单分子(Single M olecules)”杂志，表明这一领域进展迅速。但由于S M D历史较短，目前仍有许多问题有待探讨。
在检测手段上，激光诱导荧光由于灵敏度高、体系较多及激发、检测器的多样化，未来仍是S M D的主要手段。仪器商品化、提高检测速率和分子识别能力、降低检出限至10-15m ol/L以下，是该法的发展方向。寻新试剂、新体系，提高灵敏度和分子识别能力是电化学检测单分子的研究重点。
从S M D的研究对象来看，目前集中在较简单有机荧光染料分子，如罗丹明及其衍生物、IR140、IR132、香豆素类等物质。但上述荧光染料存在两大不足：一是在检测单个大分子生物活性时，易受到荧光团发射光谱性质的限制。如产生“荧光团噪音”和因环境变化产生光谱扩散、光谱跃迁等2。二是存在光漂白现象。最近，出现了一类新型荧光探针如半导体纳晶(semiconductor nanocrystals)53或半导体量子点(semiconductor quantum dots)54。与传统荧光团(有机染料)相比，它们具有窄的、可调的、对称的发射光谱、高的发光亮度和光化学稳定性，可应用于生物单分子检测和生物纳米技术。随着分析手段的发展及化学、生命科学等发展的需要，可以预见，更好性能的荧光染料(探针)开发及无机离子的单分子检测工作都将陆续展开。
拓宽应用研究领域，解决生命科学中的重大问题是S M D 今后的重点发展方向。最近Brasselet 和M oerner 55利用pH 敏感物质S NARF 21制成了单分子pH 传感器，可对细胞内微环境的pH 变化进行检测。将S M D 应用于生命科学领域，在分子水平上准确阐述生物分子结构与功能之间的关系、功能与微环境的响应等问题，可能导致生命科学新的发现56。
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Detecting Single Molecules in Solution
Liu Y anming,Liu Erbao,Cheng Jieke3
(Department o f Chemistry,Wuhan Univer sity,Wuhan430072)
Abstract Advances in science require not only the identification and detection of material′s ensemble character but als o the deep exploration of its single2m olecule chemical and physical properties.As a frontier cross2discipline research activity,studying substances at the single2m olecule level,is very im portant to research the m olecular engineering,m olecular biology,m olecular medicine,nanostructured materials and in formation.The new progress for detecting single2m olecule in s olution,including laser2induced fluorescence detection,electrochemical detection and chemilumi
nescence detection,has been reviewed in this paper and the prospects on the frontier of the research area have als o been discussed.
K eyw ords Single2m olecule detection,laser2induced fluorescence,electrochemistry,chemiluminescence,review
(Received6July2001;accepted7December2001)
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